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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达重组表达载体的连问题
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15376763881

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达重组表达载体的连问题

各位朋友大家好，我最近正在做原核表达一种蛋白，目的片段大小为489bp，用内切酶ECOR1和XHO1,连接到表达载体PET28-A.双酶切质粒和目的片段转化后平板上没有长菌！最终怀疑质粒没切开。然后分别分布酶切了质粒和片段。之后连接，结果长了几十个菌落。开始还挺高兴。可是提取重组质粒后酶切没发现目的片段，只有载体片段，但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段。。。。我很郁闷啊 ，都做了几个月了不知道原因，求各位高手帮助！感激不尽！
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1楼 2013-03-21 20:21:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-03-22 00:34:05
15376763881: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-23 09:00:24
1.“但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段”  你应该具体说下是怎么做的pcr，你测序了吗？
“最终怀疑质粒没切开”那怎么会不长菌？ 阴性对照肯定长得
用更远的酶切有看见目标大小条带么，如果你的酶切步骤发生star activity，那么很多时候还是能连上，但是序列就全变了。确认你切DNA前，里面没有混什么酒精之类的，另外我一般就切1hrs

2. 试验其他酶，或者换比如EcoRI-HF这种降低star activity的
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2楼2013-03-21 22:20:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
15376763881: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-23 09:07:54
重组质粒PCR时是否做了阴性对照？PCR可能有假阳性的。还有，你的重组质粒大小是否正确？用其他酶切是否可以切下目的片段？
我认为很可能是构建的问题，两个酶的用量没问题吧，酶切载体是否做了胶回收？我看你最好重新做酶切连接。
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3楼2013-03-22 01:49:03
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15376763881

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 15376763881 at 2013-03-23 09:20:20
有做阴性对照，用水替代模版没条带 啊。可是用酶切过的空质粒当模板怎么能扩出很亮的和目的片段大小一样的条带啊，用没有酶切过的空质粒当模板也有很暗的条带啊！郁闷。...

是不是我的pcr体系有污染啊？还是我的引物本身就能和质粒的片段相配扩出东西来。
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6楼2013-03-23 09:23:07
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-23 22:11:54
amisking: 回帖置顶 2013-03-24 19:37:57
楼主 我和你遇到过相似的情况 不是没有连进去也不是没有切开而是太少了 看不见 pET28a是表达载体 本身克隆数就低 有以下几个解决办法：
1：提质粒的时候多取点菌液，6ml吧
2：酶切的时候多切点，我切的20ul不加水。
本人的目的基因430bp，开始也看不清，后来多切了些，肉眼可以看到了。
LZ不妨试一下。
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8楼2013-03-23 21:40:06
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
15376763881: 回帖置顶 2013-03-24 09:27:38
引用回帖:
4楼: Originally posted by 15376763881 at 2013-03-23 09:07:04
我pcr程序应该没问题。模版是提取的待检重组质粒2微升，上下游引物各1微升，premixed 12.5微升，水8.5. 我测序了待检的重组菌液，可是结果显示是空质粒。   我想问，如果一个酶切开，而另一个酶没有切开质粒肯定也 ...

一个酶打开，另外一个酶没有切开，如果用这种载体做连接反应
平板上肯定会长菌，相当于载体自连哦
这两个酶都挺好用的，你还是从引物开始检查，到底是什么问题吧
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9楼2013-03-24 05:47:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 15376763881 at 2013-03-24 09:27:20
非常感谢您啊 我这也怀疑是不是一种酶不好用了,因为ecor1不是新买的，上届师姐师兄留下的，xho1是新买的。我也想问的问题就是，如果一个酶切开了而另一个酶没有切开，发生载体自连，像您说的那样会长菌？（我的长了 ...

怀疑一个酶有问题的话很容易验证，你只需分别用两个酶做单酶切，看是否能完全切开。
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14楼2013-04-15 00:12:41
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普通回帖

15376763881

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-03-21 22:20:07
1.“但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段”  你应该具体说下是怎么做的pcr，你测序了吗？
“最终怀疑质粒没切开”那怎么会不长菌？ 阴性对照肯定长得
用更远的酶切有看见目标大小条带么，如果你的酶 ...

我pcr程序应该没问题。模版是提取的待检重组质粒2微升，上下游引物各1微升，premixed 12.5微升，水8.5. 我测序了待检的重组菌液，可是结果显示是空质粒。   我想问，如果一个酶切开，而另一个酶没有切开质粒肯定也连接不上，平板上应该不会长菌吧？我没用更远的酶切，您说的星号活性是酶切时间久了可能出现吧？
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4楼2013-03-23 09:07:04
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15376763881

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 01:49:03
重组质粒PCR时是否做了阴性对照？PCR可能有假阳性的。还有，你的重组质粒大小是否正确？用其他酶切是否可以切下目的片段？
我认为很可能是构建的问题，两个酶的用量没问题吧，酶切载体是否做了胶回收？我看你最好重 ...

有做阴性对照，用水替代模版没条带 啊。可是用酶切过的空质粒当模板怎么能扩出很亮的和目的片段大小一样的条带啊，用没有酶切过的空质粒当模板也有很暗的条带啊！郁闷。
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5楼2013-03-23 09:20:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-24 19:38:06
引用回帖:
5楼: Originally posted by 15376763881 at 2013-03-23 09:20:20
有做阴性对照，用水替代模版没条带 啊。可是用酶切过的空质粒当模板怎么能扩出很亮的和目的片段大小一样的条带啊，用没有酶切过的空质粒当模板也有很暗的条带啊！郁闷。...

引物能P出以空质粒为模板的样品，说明重组质粒的PCR不可信。因为线性质粒做模板比环状的更有效，所以P出的条带更亮。我觉得你应该换一对引物试试。或者干脆用酶切来鉴定.
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7楼2013-03-23 16:37:56
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15376763881

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-03-24 05:47:05
一个酶打开，另外一个酶没有切开，如果用这种载体做连接反应
平板上肯定会长菌，相当于载体自连哦
这两个酶都挺好用的，你还是从引物开始检查，到底是什么问题吧...

非常感谢您啊 我这也怀疑是不是一种酶不好用了,因为ecor1不是新买的，上届师姐师兄留下的，xho1是新买的。我也想问的问题就是，如果一个酶切开了而另一个酶没有切开，发生载体自连，像您说的那样会长菌？（我的长了几十个菌。）很可能就是这样，要不测序怎么会是空载体呢。。引物是一个老师帮我看过也。
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10楼2013-03-24 09:27:20
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