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15376763881新虫 (小有名气)
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原核表达重组表达载体的连问题
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| 各位朋友大家好，我最近正在做原核表达一种蛋白，目的片段大小为489bp，用内切酶ECOR1和XHO1,连接到表达载体PET28-A.双酶切质粒和目的片段转化后平板上没有长菌！最终怀疑质粒没切开。然后分别分布酶切了质粒和片段。之后连接，结果长了几十个菌落。开始还挺高兴。可是提取重组质粒后酶切没发现目的片段，只有载体片段，但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段。。。。我很郁闷啊 ，都做了几个月了不知道原因，求各位高手帮助！感激不尽！ |
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cicelyzh
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3楼2013-03-22 01:49:03
【答案】应助回帖
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15376763881: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-23 09:00:24
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1.“但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段” 你应该具体说下是怎么做的pcr，你测序了吗？ “最终怀疑质粒没切开”那怎么会不长菌？ 阴性对照肯定长得 用更远的酶切有看见目标大小条带么，如果你的酶切步骤发生star activity，那么很多时候还是能连上，但是序列就全变了。确认你切DNA前，里面没有混什么酒精之类的，另外我一般就切1hrs 2. 试验其他酶，或者换比如EcoRI-HF这种降低star activity的 |
2楼2013-03-21 22:20:07
15376763881
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4楼2013-03-23 09:07:04
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5楼2013-03-23 09:20:20
