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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR引物中加入酶切位点的设计方法和酶切问题！ 新手，求帮忙！！
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人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR引物中加入酶切位点的设计方法和酶切问题！ 新手，求帮忙！！

通过RACE技术获得了基因的全长，之前是给公司做的，将其构建在了杆状病毒载体上，加了6*his-tag.  现在我想将片度从杆状病毒载体上PCR扩增下来，同时去掉HIS标签，将其构建在pAC表达载体上。想设计加酶切位点的引物。

下面是公司设计的构建到杆状病毒载体上的引物序列
                     EcoRI
F   5’-CGGATCCCG G G AATTC ATG GGTGATGAAAATGTTAATCAGG-3’                  
R   5’-CCTGCA GGC C TCGAG TTA ATGATGATGATGATGATG
                                XhoI                 6* HIS
GGCTTTAGCTCCAACCACA-3’         

我有以下几个问题，请大虾帮忙指教：

1、酶切位点的5‘端 除了加保护碱基之外，为什么还要加那么多个碱基？ 是为了平衡GC含量吗？是引物设计的时候随机加的吗？

2、我现在不要HIS标签，是不是将下游引物的HIS标签序列去除就好了。 Tm值的计算是不是不用考虑酶切位点和保护碱基，因为考虑之后，Tm值很高。

3、如果我不删除HIS标签，直接将序列从杆状病毒载体上切下，连到表达载体pAC上，his会不会影响蛋白的折叠，我表达的是一个酶的亚基，想让它在细胞内竞争细胞原有的亚基装配成全酶。
PS：我做了酶切和连接，总是得不到阳性克隆，哎~~用的EcoRI 和XhoI双酶切（NEB）5小时，连接22度2h。

4、有没有人用过invitrogen的pAC载体，可以在除了果蝇之外的昆虫细胞内表达吗？

5、怎样知道载体被双酶切开了没有呢？跑胶也看不出来？ 需要跑胶回收吗？我师姐说，如果双酶切下来的片段小就不用回收了，直接PCR产物纯化试剂盒纯化后连接就好，这样可以吗？
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1楼 2013-03-19 08:33:51
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玉米头

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-03-19 12:48:00
人生初见: 金币+1, ★有帮助 2013-03-20 05:06:00
我做的是和你类似，加几个碱性氨基酸，你可以看你用的表达载体的说明书，在哪个位点加都有说明。如果不想用组氨酸标签就可以在前面加终止密码子把其终止。
酶切的话是用肉眼看不到，你可以点一个为酶切的做对照，经酶切后跑的快，所以两条条带还是不一样的。我用的酶切位点和你的一样，做了好多次，都没连上，后来做了两次单酶切，你可以先用xhoI 且几个小时后做胶回收，然后在用EcoRI切，再做回收。连接的话最适稳定应该是16℃吧！你连接最好不要放在22℃，免得酶失活。我一般都是在16℃连8个小时，再在4℃连接一天的。你可以试试。本来做分子很多时候都是看人品。祝你好运
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2楼2013-03-19 10:42:06
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-03-20 04:56:05
1、酶切位点的5‘端 除了加保护碱基之外，为什么还要加那么多个碱基？ 是为了平衡GC含量吗？是引物设计的时候随机加的吗？
=》
从上面序列来看，酶切位点外的5‘序列的确像保护碱基，保护碱基里面也是酶切位点，至于为什么要这样做，就不明白公司当时的设计初衷了，一般来说EcoRI和XhoI的保护碱基3个碱基就够了。你说加这么多是为了平衡GC含量，有这个可能，但据个人经验，如果是以质粒为模板的话，什么样的引物扩增都会有产物，根本不用考虑Tm值和GC含量什么的。是不是随机加也不清楚。理论上可以随机加。

2、我现在不要HIS标签，是不是将下游引物的HIS标签序列去除就好了。 Tm值的计算是不是不用考虑酶切位点和保护碱基，因为考虑之后，Tm值很高。
=》
不要HIS标签，是这样的将下游引物的HIS标签序列去除，但注意终止密码子不能去。理论上以质粒为模板，引物的设计不用考虑Tm值和引物GC含量什么的。如果要考虑的话，那么引物Tm值的计算应不包括酶切位点和保护碱基，因为他们并不与模板退火。

3、如果我不删除HIS标签，直接将序列从杆状病毒载体上切下，连到表达载体pAC上，his会不会影响蛋白的折叠，我表达的是一个酶的亚基，想让它在细胞内竞争细胞原有的亚基装配成全酶。
PS：我做了酶切和连接，总是得不到阳性克隆，哎~~用的EcoRI 和XhoI双酶切（NEB）5小时，连接22度2h。
=》
不删除HIS标签，直接将序列从杆状病毒载体上切下，连到表达载体pAC上，his会不会影响蛋白的折叠，这个不好说，但是不影响的概率比较大，毕竟6His还是比较小。
“做了酶切和连接，总是得不到阳性克隆，哎~~用的EcoRI 和XhoI双酶切（NEB）5小时，连接22度2h。”
不知道你将片段用EcoRI和XhoI从杆状病毒载体切下后，是否能看到条带，
你总是得不到阳性克隆，不知道你挑的克隆的空载体还是什么，如果是空载体的话，说明你载体的双酶切不干净，这样可以酶切少量的载体试试，载体量可低至200ng，酶切2小时足够了。连接22度2h，不知道你用的什么连接kit，如果是T4 ligase的话，建议16度连8小时以上，或者过夜。

4、有没有人用过invitrogen的pAC载体，可以在除了果蝇之外的昆虫细胞内表达吗？
=》
这个问题不清楚，你可以查阅相关文献。

5、怎样知道载体被双酶切开了没有呢？跑胶也看不出来？ 需要跑胶回收吗？我师姐说，如果双酶切下来的片段小就不用回收了，直接PCR产物纯化试剂盒纯化后连接就好，这样可以吗？
=》
保证载体被双酶切开的话，那就要酶切少量的载体，可低至200ng,的确如你师姐所说，如果切下来的片段很小的话，只有20bp以内的话，可以不用跑胶，可以直接用PCR产物或者胶回收纯化试剂盒纯化后连接即可。

希望我的解答对你有用。
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3楼2013-03-19 12:47:25
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-19 12:47:25
1、酶切位点的5‘端 除了加保护碱基之外，为什么还要加那么多个碱基？ 是为了平衡GC含量吗？是引物设计的时候随机加的吗？
=》
从上面序列来看，酶切位点外的5‘序列的确像保护碱基，保护碱基里面也是酶切位点，至 ...

谢谢你的回答，好详细。 关于酶切和连接问题，我用的是fermentas的T4连接酶，说明书上说22度1h就可以。还有虫友说连接一般不会出现问题，大多是因为酶切不充分。 我从载体上切目的片段是看到了有目的片段大小的带切下来，但是还有其它两条带，像是酶切有星活性了。
但是对空载体的酶切，跑胶后看是和未酶切的有差异，但是连接时候做了酶切空载体的对照，载体自连的克隆很多，所以是不是酶切还是不够充分？但是切得时间久了我又担心星活性。
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4楼2013-03-20 05:04:44
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 玉米头 at 2013-03-19 10:42:06
我做的是和你类似，加几个碱性氨基酸，你可以看你用的表达载体的说明书，在哪个位点加都有说明。如果不想用组氨酸标签就可以在前面加终止密码子把其终止。
酶切的话是用肉眼看不到，你可以点一个为酶切的做对照，经 ...

谢谢你，你的回答还是很有帮助的。  

我打算再试一次，如果还不行就分次单酶切。

看来真是看人品啊。
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5楼2013-03-20 05:07:19
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