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小科研女dow

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 总结的很详细,一目了然,鼓励应助,期待更多精彩的回答! 2013-03-15 00:34:01
小丹木木: 金币+2, MolEPI+1, 详细,热心,鼓励给予EPI 2013-03-15 08:04:36
简单说几句撒
1 首先知道了序列后设计引物
2 做引物PCR
3 电泳验证序列大小
4 切胶回收
5 与T载体连接后转换涂平板
6 依据平板菌落做菌落PCR
7 电泳验证菌落PCR结果选择正确的单菌落送去测序
8 测序结果在NCBI上BLAST证明为你所要的序列
9 挑测序正确的单菌落姐试管或者摇瓶后进行质粒中提
10 再做引物PCR
11回收PCR产物
12 将回收片段与所要载体进行双酶切
12 连接转化进入感受态后涂平板
13 质粒中提 转化进入表达感受态中
14 诱导表达
15 细胞破碎(胞内产物的话)得到粗蛋白
16 蛋白纯化(若有HIS过镍柱纯化,若无,硫酸铵梯度纯化)
17 得到纯化后的蛋白为你所用


PS:与T载体连接的一步可有可无。若急于知道是否序列正确,可先这样做。
做出色的科研人
3楼2013-03-14 22:00:19
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