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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶活性测定 （葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）
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也雨seahorse

金虫 (小有名气)

[求助] 酶活性测定 （葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）

谁有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性在植物组织中怎么测定的方法，麻烦给我一下，谢了，或者是测定Isolation of apoplastic fluids and intracellular soluble fractions这个的方法，越详细越好。注意是植物组织中的，不用试剂盒的方法。

[ Last edited by wizardfan on 2013-3-10 at 09:43 ]
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1楼 2013-03-09 20:27:27
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jzhe961

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

G6PDH的活性还是很好测的。植物样品一般是液氮速冻-80下保存， extraction buffer 在研钵研磨成为匀浆，离心后上清直接可以用于酶活测定。
Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)
Ref: Adapted from Hauschild, R. and von Schaewen A. (2003) Plant physiol. 133: 47-62

Principle: Oxidation of glucose-6-phosphate to 6-phosphogluconolactone concomitant with reducing NADP to NADPH.


The blank rate is recorded in absence of G6P in the assay mix and must be substracted from the G6P reaction rate.

Final concentration :        Stock concentration :
Assay Buffer
- Tris-HCl                           100mM, pH 8.0
        Assay buffer 2X
- Tris-HCl                        200 mM, pH 8.0
Substrates
- G6P                                                  2 mM
- NADP                                           0.2 mM
        Substrates
- G6P                                             100 mM
- NADP                                           50 mM


Before measurements, 30uL of crude extract diluted 10 times was used for 10 min pre-incubation at room To, one sample in the presence of 62.5 mM DTT (final concentration) and another one in the absence of reductant (H20).  Contribution of cytosolic and plastidic isoenzymes is based on differential calculation of G6PDH activity measured in the absence (TOTAL) and presence of DTT (CYTOSOLIC): Total minus cytosolic is equal to plastidic activity.

Mix everything without sample.  Deposit pre-incubated sample in wells and add blank or assay mix to start the reaction
Observation: Reduction of NADP at 340 nm, 30°C.
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2楼2013-03-12 22:07:44
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也雨seahorse

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jzhe961 at 2013-03-12 22:07:44
G6PDH的活性还是很好测的。植物样品一般是液氮速冻-80下保存， extraction buffer 在研钵研磨成为匀浆，离心后上清直接可以用于酶活测定。
Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)
Ref: Adapted from Hauschi ...

麻烦你能不能说详细些，我看的不是很明白，比如说提取液，反应液，及空白处理及用量，非常感谢！
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3楼2013-03-13 13:03:39
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