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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » a-淀粉酶的酶活性测定
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敏贤豆豆

新虫 (小有名气)

[求助] a-淀粉酶的酶活性测定

想测定酶液的活性，自己找了一个方法测，用碘液和紫外可见分光光度计测与淀粉反应后的样液的吸光度，然后求出浓度的方法。但是还是好多疑问，这个方法貌似要先估算酶的活力再稀释的，但是拿到一瓶酶样液，该怎么估计它的活力？然后稀释多少倍去测？想问问大家是用什么方法测定的？有什么要注意的，麻烦详细点，谢谢！
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1楼 2012-10-15 19:46:00
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aloon111

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品量允许的话，可以先来个梯度尝试嘛，然后确定了一个范围再...
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汇天下之贤
2楼2012-10-15 19:56:47
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以按不稀释，稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍来做一下预实验，看看哪个浓度范围内的比较合适，然后再在该浓度范围内做一个密一点的梯度稀释，确定最终稀释倍数。
用分光光度计测淀粉浓度，要先做标准曲线，酶反应前后的淀粉浓度都需要控制在标准曲线的淀粉浓度范围，否则结果不可信。
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3楼2012-10-15 23:25:46
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敏贤豆豆

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aloon111 at 2012-10-15 19:56:47
样品量允许的话，可以先来个梯度尝试嘛，然后确定了一个范围再...

试过把酶取1ml稀释了250倍，反应5min后证明淀粉被反应完了，加入碘液没变色，但是吸光度是89%，不在文献提供的浓度-吸光度的转换表中，而且我也怀疑5min内可能早就消耗完了加入的淀粉，如果以5min来算酶活的话，应该不准了吧？我认为酶的浓度可以再稀释点，本来打算是让它在5min内不把所有的淀粉水解完，然后我就可以通过吸光度测得剩下淀粉的浓度，可以推算酶的活力的，但是我再从250中取了1ml稀释250倍，反应了5min后加入碘液，溶液变得好黑，测了吸光度是0.2%，也不在浓度-吸光度的转换表里查到，我郁闷了，很怀疑这种方法可不可行？我的酶是太稀了还是太浓了？要怎样才能测出转换表里的吸光度范围（大概30%~50%）不知道你们怎么看。。。
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4楼2012-10-16 10:59:38
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敏贤豆豆

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hippo_li at 2012-10-15 23:25:46
可以按不稀释，稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍来做一下预实验，看看哪个浓度范围内的比较合适，然后再在该浓度范围内做一个密一点的梯度稀释，确定最终稀释倍数。
用分光光度计测淀粉浓度，要先做标准曲线，酶反 ...

我做了稀释100倍、250倍、250*250倍都做了，但是没有一个能测出想要的吸光度。。。
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5楼2012-10-16 11:01:39
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敏贤豆豆

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 敏贤豆豆 at 2012-10-16 10:59:38
试过把酶取1ml稀释了250倍，反应5min后证明淀粉被反应完了，加入碘液没变色，但是吸光度是89%，不在文献提供的浓度-吸光度的转换表中，而且我也怀疑5min内可能早就消耗完了加入的淀粉，如果以5min来算酶活的话，应 ...

后来从250ml里取了1ml，再稀释了10倍，还是相同的情况，反应5min后以加入碘液就立马变黑，不知道该怎么办？
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6楼2012-10-16 11:03:16
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你必须先做标准曲线，变黑是因为碘与淀粉反应了，估计是你的淀粉含量太高了，要稀释后才能测得到吸光度。建议你先不要用酶来做反应，先找好合适的检测条件再做，查查文献，看看别人的操作是怎样的。
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7楼2012-10-16 12:31:00
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