24小时热门版块排行榜

返回列表

哈皮miao

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 423.4
帖子: 57
在线: 43.1小时
虫号: 1720173

[交流] 基因克隆技术并使用大肠杆菌表达一种蛋白的一般流程

设计引物——PCR扩增目的基因片段（DNA电泳鉴定）——目的基因与克隆载体连接（DNA电泳鉴定）——重组质粒导入感受态细胞——扩大培养，提取重组质粒——酶切目的基因并与表达载体连接（DNA电泳鉴定）——重组质粒导入受体菌——扩大培养提取蛋白

请问各位大致流程是我理解的这样吗？还有几个问题：
1.为什么目的基因不能直接经过PCR扩增之后与表达载体连接，而要经过克隆载体连接，再切下来，再与表达载体连接呢？
2.感受态细胞与受体菌在使用之前都要先活化吗？

回复此楼

» 猜你喜欢

E0414, 我的本子有没有希望？已经有9人回复
青A35岁以下通知答辩了吗已经有3人回复
【全奖博士/科研助理/博后招生】新加坡南洋理工大学机械与航空航天学院已经有4人回复
希望面上有个好结果已经有7人回复
三区计算机方向期刊推荐已经有5人回复
sci论文二审求助已经有5人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

大肠杆菌BL21菌株表达目的蛋白时，菌液破碎前后的浑浊程度变化很不明显已经有5人回复
基因克隆表达中信号肽的问题已经有11人回复
大肠杆菌表达42kd的蛋白，蛋白电泳显示只有35kd，测酶活还比较高，这是怎么回事儿呢？已经有9人回复
求大神指点不同种类的大肠杆菌对密码子的偏好性有声么影响？已经有8人回复
蛋白表达可不可能存在内含肽剪接已经有7人回复
真菌的基因克隆与表达为什么要去除内含子？已经有5人回复
基因工程课程小结已经有20人回复
同时表达两种蛋白表达问题已经有3人回复
大肠杆菌表达蛋白提取总不成功，求助高手指教！已经有5人回复
膜蛋白表达问题已经有15人回复
克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？已经有17人回复
【求助】真核基因在原核生物表达已经有4人回复
【求助/交流】大肠杆菌有的是表达载体的宿主，有些事克隆载体的宿主，他们的区别在哪� 已经有10人回复
【求助/交流】大肠杆菌某段基因的克隆问题已经有3人回复
【求助/交流】枯草中表达外源基因，有蛋白，但是没有酶活，是什么原因？已经有4人回复
【求助/交流】大肠杆菌表达系统蛋白酶对目的蛋白的水解问题已经有11人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2013-03-04 15:44:20

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

zjl01234

银虫 (正式写手)

应助: 42 (小学生)
金币: 412.3
帖子: 399
在线: 218.5小时
虫号: 1021171

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
哈皮miao: 金币+2 2013-04-07 10:54:48

最开始应该是获得目的基因，可以从基因文库、cDNA文库或者gene bank里找，或者找公司买、合成，然后再PCR扩增，制备很多的拷贝进行下一步实验。至于与表达载体连接，我觉得这是用来保存目的基因，并在将来要用到这个基因的时候能很快获得大量拷贝，因为一个基因片段如果只保存在缓冲液里是不能长久的，而且以后要用很多拷贝的话如果用PCR扩增错误的判断会越来越多，PCR的特异性没有用细菌来表达扩增来的给力。

赞一下