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哈皮miao

银虫 (小有名气)

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[交流] 基因克隆技术并使用大肠杆菌表达一种蛋白的一般流程

设计引物——PCR扩增目的基因片段（DNA电泳鉴定）——目的基因与克隆载体连接（DNA电泳鉴定）——重组质粒导入感受态细胞——扩大培养，提取重组质粒——酶切目的基因并与表达载体连接（DNA电泳鉴定）——重组质粒导入受体菌——扩大培养提取蛋白

请问各位大致流程是我理解的这样吗？还有几个问题：
1.为什么目的基因不能直接经过PCR扩增之后与表达载体连接，而要经过克隆载体连接，再切下来，再与表达载体连接呢？
2.感受态细胞与受体菌在使用之前都要先活化吗？

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1楼 2013-03-04 15:44:20

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zjl01234

银虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
哈皮miao: 金币+2 2013-04-07 10:54:48

最开始应该是获得目的基因，可以从基因文库、cDNA文库或者gene bank里找，或者找公司买、合成，然后再PCR扩增，制备很多的拷贝进行下一步实验。至于与表达载体连接，我觉得这是用来保存目的基因，并在将来要用到这个基因的时候能很快获得大量拷贝，因为一个基因片段如果只保存在缓冲液里是不能长久的，而且以后要用很多拷贝的话如果用PCR扩增错误的判断会越来越多，PCR的特异性没有用细菌来表达扩增来的给力。

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