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jiangcheng14

金虫 (小有名气)

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[求助] 如何确定一段线性DNA的末端序列

一段已知序列的质粒，被一个蛋白切了一刀，成为线性，如何确定切出的线性DNA的末端序列。所切出的DNA末端是平端或粘性末端未知。

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1楼2013-02-28 18:14:46

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mascotte

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 说的很详细 2013-03-01 10:44:39
jiangcheng14: 金币+20 2013-03-02 16:30:55

既然质粒序列已知，就可以选取能够酶切改质粒的已知内切酶，举例来说，如果质粒的大小是2000，可以选取A,B两个内切酶，，且A,B的位置离得稍远即可，例如200bp。未知蛋白用X表示。X的位置有三种可能，1，在A,B间；2，在AB外；3，在A和B上；
如果是第三种情况，用X切过以后，A（或B）将不能再切割该质粒，说明X的位置在A（或B）附近；
在第一种情况下，A,B双酶切后出现的一大一小两个片段，小的能被X切开，大的不能；
这两种情况下，在A的位置酶切位点附近设计测序引物，以A和X双切的小片段作为模板，做测序PCR，测序即可得到X切割后的末端序列。

第二种情况下X能切割AB双切后的大片段，此时可以先用A和X双切质粒，再用B切两个片段，确定X在B的近端或是远端，并通过切开的片段大小确定ABX三者在质粒上的大致位置。之后在X大致位置上游设计测序引物，以x切割后的质粒做模板测序即可。