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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆拟南芥的基因，为什么每次测序结果出来都是比TAIR网站上标注的序列多出20个碱基呢
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凡凡高高高

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆拟南芥的基因，为什么每次测序结果出来都是比TAIR网站上标注的序列多出20个碱基呢

最近在做载体构建，但是在克隆上就出现了问题，使得实验难有进展，以cDNA做模板，为什么每次克隆出来的得基因序列都比TAIR网站上标注的序列多出20个碱基呢？是网站上的信息错误还是操作的原因？又该怎么应对这种情况呢？求大神指点
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1楼 2013-02-21 21:12:38
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是编码区序列多了20个碱基吗？在NCBI上做个Blast看下，TAIR网站上的序列是col基因型的序列，你确定你的拟南芥是同一基因型？
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2楼2013-02-22 12:41:02
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凡凡高高高

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2013-02-22 12:41:02
是编码区序列多了20个碱基吗？在NCBI上做个Blast看下，TAIR网站上的序列是col基因型的序列，你确定你的拟南芥是同一基因型？

是编码区多了20个碱基啊，拟南芥也是col生态型，多出的这20个碱基在TAIR网站上显示的是内含子的后半段序列
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3楼2013-02-22 17:40:56
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凡凡高高高 at 2013-02-21 21:40:56
是编码区多了20个碱基啊，拟南芥也是col生态型，多出的这20个碱基在TAIR网站上显示的是内含子的后半段序列...

也就是说你的cDNA序列中多了20个碱基，这20个碱基本应该是内含子的序列？那这样从这20个碱基往后就出现了移码突变是吗？呵呵，很怪异。
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4楼2013-02-23 10:47:40
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是不同的转录本吧，你再查一下！
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5楼2013-02-23 17:07:57
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十比

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

网上的都是软件预测的，外显子与内含子边界也有可能有错误的，肯定以你自己测出来的为准。
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6楼2013-02-26 16:57:12
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korc

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

Tair的序列, 如果是没有人报道过的, 可能会有问题, 我遇到过内含子剪接预测位置出问题的情况. 一切以你测序为准!
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7楼2013-02-26 17:39:36
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fantasist001

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果你从不同实验合成的cDNA样品都得到这个序列，那么恭喜楼主，你可能发现了TAIR内没有的新的transcript variant。
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8楼2013-08-23 18:50:59
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

嗯...............
        问下楼主的cDNA合成时用的OligodT还是OligodT和Random Hexamers混合方式？我以前采用后一种cDNA合成方式，扩一个较长的基因（大概3.5Kb）时就出现了融合有4bp的内含子序列（其他均正确），当初分析的就是没有用DNaseI处理RNA，导致gDNA微量存在，使扩增过程出现错误。因为实验过程嫌DNaseI处理会损失RNA我就没有做，其实这点很必要的。Random Hexamer是无节操性结合的引物，所以产生这种融合现象并不奇怪。
       楼上各位说的variant也是可能的。TAIR并不是唯一。      
       所以嘛，和PCR有关的实验怪异现象，非常之多，因为PCR本身就是一个神奇的技术~（笑）
       个人看法，若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
9楼2013-08-23 19:44:45
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