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凡凡高高高金虫 (小有名气)
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[求助]
克隆拟南芥的基因，为什么每次测序结果出来都是比TAIR网站上标注的序列多出20个碱基呢
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| 最近在做载体构建，但是在克隆上就出现了问题，使得实验难有进展，以cDNA做模板，为什么每次克隆出来的得基因序列都比TAIR网站上标注的序列多出20个碱基呢？是网站上的信息错误还是操作的原因？又该怎么应对这种情况呢？求大神指点 |
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atlanticwi
金虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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嗯............... 问下楼主的cDNA合成时用的OligodT还是OligodT和Random Hexamers混合方式？我以前采用后一种cDNA合成方式，扩一个较长的基因（大概3.5Kb）时就出现了融合有4bp的内含子序列（其他均正确），当初分析的就是没有用DNaseI处理RNA，导致gDNA微量存在，使扩增过程出现错误。因为实验过程嫌DNaseI处理会损失RNA我就没有做，其实这点很必要的。Random Hexamer是无节操性结合的引物，所以产生这种融合现象并不奇怪。 楼上各位说的variant也是可能的。TAIR并不是唯一。 所以嘛，和PCR有关的实验怪异现象，非常之多，因为PCR本身就是一个神奇的技术~（笑） 个人看法，若有说错请高手指点 |
9楼2013-08-23 19:44:45