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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后切胶回收
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fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后切胶回收

各位虫友好：
目前，我正在做质粒双酶切，体系40ul：
dd水                       补足40ul
10Xtango buffer     4ul
质粒                       2ug
kpnI                        2ul
bglII                        2ul
37℃反应5h,电泳检测图如下：

目的是为了回收目的条带（300多bp），切胶回收用了takara的和axygen的，都没有回收到，跑胶没有任何条带。接下来我要做的是将目的基因连接到表达载体中，回收不到怎么办哪？求帮助！！！

2013-1-20双酶切_副本.jpg
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1楼 2013-01-23 17:10:19
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-23 22:12:27
一般克隆时，设计一个连接反应，载体需要100ng左右，根据分子数比例（外源片段是载体的3-10倍），事实上，需要的外源片段的绝对量很少（一般不超过50ng).
但考虑到回收的小片段定量的准确性，一般回收到的小片段浓 ...

O(∩_∩)O谢谢
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10楼2013-01-24 10:21:32
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-23 18:55:12
fayzhao: 金币+1 2013-01-23 18:55:27
你得把marker的条带标出来。和提质粒一样，最后一步洗脱之前的酒精去除比较重要。切胶时不要切太多无用胶进去，影响回收效率。之前我也遇到过这个问题，提高浓度比较重要
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我还年轻，我要上路！
2楼2013-01-23 17:55:50
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fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2013-01-23 18:54:47
补充：marker条带分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp
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3楼2013-01-23 18:54:39
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 转基因猴子 at 2013-01-23 17:55:50
你得把marker的条带标出来。和提质粒一样，最后一步洗脱之前的酒精去除比较重要。切胶时不要切太多无用胶进去，影响回收效率。之前我也遇到过这个问题，提高浓度比较重要

我把产物全部进行回收，回收胶在切胶的紫外下都看不到目的条带了……基本都没法切，最后我还是切了，最后检测什么也没有回收到。
那你最后怎么解决的呢？怎么提高浓度？提高质粒的浓度还是什么？谢谢啦
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4楼2013-01-23 18:58:07
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