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18853850850

金虫 (正式写手)

[求助] 关于原核表达

最近在用BL21表达一个蛋白,这个蛋白有100多KD,表达量比较低,大量诱导之后用含8M 尿素的Buffer溶解,蛋白量很少,我要纯化这个蛋白做检测用,需要一定的蛋白量,纯化过一次最后接下来的东西什么都没有,怎么回事啊,请教一下哪位高手能指点指点。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
18853850850: 金币+2 2013-02-01 09:58:34
18853850850: 金币+3 2013-02-01 09:59:34
你是指诱导条件下本身蛋白就少,还是说复性率低?用尿素复性本身有些时候就比较麻烦,复性出来的蛋白未必与体内活性形式一样。如果需要活性蛋白,优化条件有时候能达到不错的可溶蛋白量,接下来的工作反而轻松。
2楼2013-01-04 11:08:40
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的分子量大,应该有包涵体吧。如果直接电泳的话含量如何?8M尿素复性会非常困难,建议实用其他的复性条件
shine
3楼2013-01-04 15:39:14
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18853850850

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-04 11:08:40
你是指诱导条件下本身蛋白就少,还是说复性率低?用尿素复性本身有些时候就比较麻烦,复性出来的蛋白未必与体内活性形式一样。如果需要活性蛋白,优化条件有时候能达到不错的可溶蛋白量,接下来的工作反而轻松。

蛋白本身表达的不多,用尿素溶解看不到被浓缩了;蛋白有没有活性不重要,只想拿到纯的蛋白就行。
学自己想知道的
4楼2013-01-05 12:10:58
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18853850850

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhang881007 at 2013-01-04 15:39:14
你的分子量大,应该有包涵体吧。如果直接电泳的话含量如何?8M尿素复性会非常困难,建议实用其他的复性条件

直接电泳看不到明显的条带
学自己想知道的
5楼2013-01-05 12:11:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
18853850850: 金币+3 2013-02-01 09:59:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18853850850 at 2013-01-05 12:10:58
蛋白本身表达的不多,用尿素溶解看不到被浓缩了;蛋白有没有活性不重要,只想拿到纯的蛋白就行。...

如果表达量本身就低,先优化下诱导条件吧,温度、IPTG浓度、时间什么的。不同蛋白最优条件不同的。
如果不在乎是否有活性,直接大量表达很有可能形成包涵体,纯化起来挺容易的,不过复性起来有时候头痛。
6楼2013-01-05 12:56:27
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xinmiao94

禁虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+2, 鼓励新虫发帖 2013-01-25 07:13:02
18853850850: 金币+2 2013-02-01 09:59:16
本帖内容被屏蔽

7楼2013-01-24 15:16:37
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18853850850

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by xinmiao94 at 2013-01-24 15:16:37
有的蛋白本身就低,纯化前做没做SDS-PAGE没?纯化前用没用超声波破碎菌体?

做过,蛋白没有得到浓缩,与原始菌液中蛋白量相当
学自己想知道的
8楼2013-01-25 10:52:44
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xinmiao94

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

9楼2013-07-03 11:13:37
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