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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于原核表达
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18853850850

金虫 (正式写手)

[求助] 关于原核表达

最近在用BL21表达一个蛋白，这个蛋白有100多KD,表达量比较低，大量诱导之后用含8M 尿素的Buffer溶解，蛋白量很少，我要纯化这个蛋白做检测用，需要一定的蛋白量，纯化过一次最后接下来的东西什么都没有，怎么回事啊，请教一下哪位高手能指点指点。
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学自己想知道的
1楼 2013-01-04 10:00:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
18853850850: 金币+2 2013-02-01 09:58:34
18853850850: 金币+3 2013-02-01 09:59:34
你是指诱导条件下本身蛋白就少，还是说复性率低？用尿素复性本身有些时候就比较麻烦，复性出来的蛋白未必与体内活性形式一样。如果需要活性蛋白，优化条件有时候能达到不错的可溶蛋白量，接下来的工作反而轻松。
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2楼2013-01-04 11:08:40
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的分子量大，应该有包涵体吧。如果直接电泳的话含量如何？8M尿素复性会非常困难，建议实用其他的复性条件
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shine
3楼2013-01-04 15:39:14
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18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-04 11:08:40
你是指诱导条件下本身蛋白就少，还是说复性率低？用尿素复性本身有些时候就比较麻烦，复性出来的蛋白未必与体内活性形式一样。如果需要活性蛋白，优化条件有时候能达到不错的可溶蛋白量，接下来的工作反而轻松。

蛋白本身表达的不多，用尿素溶解看不到被浓缩了；蛋白有没有活性不重要，只想拿到纯的蛋白就行。
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学自己想知道的
4楼2013-01-05 12:10:58
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18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhang881007 at 2013-01-04 15:39:14
你的分子量大，应该有包涵体吧。如果直接电泳的话含量如何？8M尿素复性会非常困难，建议实用其他的复性条件

直接电泳看不到明显的条带
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学自己想知道的
5楼2013-01-05 12:11:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
18853850850: 金币+3 2013-02-01 09:59:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18853850850 at 2013-01-05 12:10:58
蛋白本身表达的不多，用尿素溶解看不到被浓缩了；蛋白有没有活性不重要，只想拿到纯的蛋白就行。...

如果表达量本身就低，先优化下诱导条件吧，温度、IPTG浓度、时间什么的。不同蛋白最优条件不同的。
如果不在乎是否有活性，直接大量表达很有可能形成包涵体，纯化起来挺容易的，不过复性起来有时候头痛。
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6楼2013-01-05 12:56:27
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xinmiao94

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+2, 鼓励新虫发帖 2013-01-25 07:13:02
18853850850: 金币+2 2013-02-01 09:59:16
本帖内容被屏蔽
7楼2013-01-24 15:16:37
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18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xinmiao94 at 2013-01-24 15:16:37
有的蛋白本身就低，纯化前做没做SDS-PAGE没？纯化前用没用超声波破碎菌体？

做过，蛋白没有得到浓缩，与原始菌液中蛋白量相当
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学自己想知道的
8楼2013-01-25 10:52:44
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xinmiao94

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
9楼2013-07-03 11:13:37
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