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hubinghello金虫 (小有名气)
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大家是怎么稀释引物的 已有6人参与
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| 各位童鞋，你们新拿到的引物粉末一般离心多少速度多长时间？加水稀释后，又旋涡震荡多长时间呢？时间久了会有什么影响吗 |
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-07 12:04:56
gyesang: 回帖置顶 2012-12-08 21:17:27
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引物合成报告单 分子量Molecular Weight（MW） ①分子量MW=碱基个数×324.5（每个核苷酸的平均分子量） ②分子量MW=(A×313.21)+( G×329.21)+( C×289.19)+(T×304.20)-61.97 注：A、T、G、C分别代表引物中A、T、G、C四种碱基的个数 熔解温度Melting Temperature（Tm） 是指DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。Tm值与GC含量和碱基数量成正比关系。引物单上会提供一个高盐浓度的Tm值和一个低盐浓度的Tm值，是公司让我们在摸索自己的体系的Tm值时有一个大概的范围吧。不过不同生物公司计算Tm值得方法都不一样，要做PCR可以按照后一个，不过最好是按照自己用软件设计的Tm-（5-10度）来进行PCR。当上下游引物Tm值不同时按照低的引物的Tm值设计退火温度。 吸光值Optical Density（OD） 表示被检测物吸收掉的光密度。由于核酸在260 nm附近有强吸收，因此常根据此性质，用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值，据此对核酸进行定量，用OD值来表示。1 OD是指：置于光路长度为1 cm的比色皿中的DNA/RNA溶液，如果其在260 nm处的吸光度值为1，则称1 ml该溶液中溶解的DNA/RNA的量为1 OD。1个OD值的合成DNA/RNA的质量约为33 μg。 n moles per OD 表示每个OD值的引物中含有X n moles。用于引物稀释时计算引物的终浓度。 ①引物浓度μM（μ mol / L）= n / V = [ X n moles / 1000 ] μ mol / [ VμL / 1000000 ] L ②引物浓度μM（μ mol / L）=（OD值×33 μg / MW）/ [ VμL / 1000000 ] L 注：V表示加入的无菌TE（pH8.0）或者双蒸水（最好要用调整过pH8.0值的双蒸水） 简单的说：若n moles per OD = X，要稀释成10 μM 的终浓度，需要加入的TE或者双蒸水的体积为100X（μL）。 纯化方式Purifaction 表示引物的纯化方式。一般的引物的纯化方式有如下几种： ①C18柱脱盐：又称简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶剂溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ②OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge)纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMT基）和树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物、各种探针等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时，制品的纯度得不到保证。 ③PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)纯化： PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于45 mer)的纯化特别有效。如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等，请选用PAGE纯化制品。 ④HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。由于制品纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。特别是：PCR克隆、定点突变、人工合成基因等。不过，本法只对纯化较短序列 (＜40 mer)特别有效，合成更长序列 (≥40 mer)时，PAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。尽管对于较长序列 (≥40 mer)，PAGE纯化效果要优于HPLC纯化，但如果实验对制品的纯度要求非常高，HPLC与PAGE双重精制会提供更好的制品纯度。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。 引物的稀释与保存 1、引物的稀释 一般合成引物总量为2 OD，分装成两管，每管1 OD（一般仅稀释一支，另一支置于-20℃冰箱备用） （1）12000 rpm 离心3-5分钟。因合成的引物常以干粉的形式提供，真空干燥后呈薄膜状或者粉末状附在离心管中，为了防止开盖时引物干粉散失故稀释前最好离心，使之集中于管底。 （2）轻轻打开管盖，加入适量的无菌TE（pH8.0）或者双蒸水（最好要用调整过pH8.0值的双蒸水）稀释至所需浓度。加入的体积参照n moles per OD中的说明。稀释引物，一般先配成储存液（100 μM），再吸取一部分配成工作液（10 μM），分装成小管。这样的好处是引物不容易降解，引物忌讳反复冻融。 （3）振荡后瞬时离心，静置待用 2、引物的保存 （1）未稀释的引物干粉很稳定，放置于-20℃可以保存1年。 （2）储存液（100 μM）放置于-20℃也可以长期保存. （3）工作液（10 μM）短期内经常使用（1-2周），可放置在4℃下保存，长期保存请放置于-20℃。 （4）荧光标记引物请避光保存。 |
4楼2012-12-07 09:20:35
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