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引物二聚体会不会影响目的基因的迁移?
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如题 简单点说：切胶的时候 会不会你切300bp的条带 实际上是350bp或250bp长？ 或者 小片段会夹杂在大片段里 你切的大片段里最终还是存在有部分小片段？ 两个疑问 大家畅所欲言吧 |
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2楼2012-11-24 14:52:21
seanzhu1996
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5楼2012-11-24 18:47:59
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
曾秀凤: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 我们也是EB后染的 所以应该片段选择比较精确 对吧 结果切胶回收后检测还是会发现目的片段里有小片段的存在 所以很困惑 2012-11-26 08:54:12
感谢参与，应助指数 +1
曾秀凤: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 我们也是EB后染的 所以应该片段选择比较精确 对吧 结果切胶回收后检测还是会发现目的片段里有小片段的存在 所以很困惑 2012-11-26 08:54:12
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你的问题应该分3个层面回答。1，引物二聚体不影响目的产物的迁移。2，目的带的大小想精确反映在胶上，电泳时不能加核酸染料，跑完胶后在再染色，跑出来是多大就是多大，不失真，不会出现250bp看起来像300bp的情况。3，如果想分开大小很接近两条带，需要提高分辨率，提高胶浓度是个好办法。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
6楼2012-11-25 08:11:25
yyll1988
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8楼2012-11-26 08:54:22
zhengli123
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9楼2012-11-27 08:49:27
【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+1, 鼓励新人交流！ 2012-12-09 00:37:04
曾秀凤: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 你分条说的很清楚了 谢谢啊 但是呢 我切胶前后都会在凝胶成像仪上拍下照片确定切下的一定是目的条带 我们用2%的低熔点琼脂糖跑2-3h 就这样 通过芯片检测 还是会发现夹杂有小片段 呵呵 虽然对结果的影响不是很大 就只是觉得很奇怪于这种现象而已 2012-12-12 10:08:15
gyesang: 金币+1, 鼓励新人交流！ 2012-12-09 00:37:04
曾秀凤: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 你分条说的很清楚了 谢谢啊 但是呢 我切胶前后都会在凝胶成像仪上拍下照片确定切下的一定是目的条带 我们用2%的低熔点琼脂糖跑2-3h 就这样 通过芯片检测 还是会发现夹杂有小片段 呵呵 虽然对结果的影响不是很大 就只是觉得很奇怪于这种现象而已 2012-12-12 10:08:15
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问题1：切胶的时候 会不会你切300bp的条带 实际上是350bp或250bp长？ 回答：这个是有可能的，即便你点的双个marker, 但由于凝胶的问题或者电泳系统的问题亦或者marker本身精确度不高的问题，完全有可能出现这种情况。建议在切胶前，在成像系统上看一下再切，确定你的目的产物确实存在并确定目的条带的位置，或者可以再UV板上看着切（这个要做好防护，建议还是在成像系统上看确定一下目的条带就可以了）。 问题2：小片段会夹杂在大片段里 你切的大片段里最终还是存在有部分小片段？ 回答：这个也完全可能，特别是电泳时间不够充分且存在于目的条带大小相近的非特异性扩增条带的情况下极为容易出现相近大小的条带没有完全分开，或者切胶不够精细也可能发生这样的问题。 问题3：引物二聚体是否会影响目的基因迁移？ 回答：如果你的目的条带是300bp这个不会，但是如果产物很小，小于100bp，就有可能。但是，一般普通PCR或Real-time PCR 都会建议你目的条带大于100-150bp，所以引物二聚体不会影响目的基因迁移。但是也要优化引物，尽量避免大量引物二聚体的产生，大量引物二聚体的产生会影响扩增效率。 但愿这些答案对你有帮助。 |
10楼2012-12-08 21:20:49