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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Western总蛋白提取时需要胞内蛋白和一个膜上受体蛋白，要不要最后一步高速离心？
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AMU_801

银虫 (小有名气)

[求助] Western总蛋白提取时需要胞内蛋白和一个膜上受体蛋白，要不要最后一步高速离心？ 已有2人参与

我以前的方法是
弃原培养基---预冷PBS漂洗---刮刀收集至1.5mlEP管---1000rpm离心5min---预冷PBS洗涤---2000rpm离心5min---弃尽管内液体，加入60ul裂解液---冰上裂解30min---12000rpm离心5min---收集上清得总蛋白溶液

今天老师说这样会损失我需要的那个膜上受体蛋白，换方法
弃原培养基---预冷PBS漂洗---加入100ul裂解液，冰上5min---刮刀收集至EP管，冰上10min

老师意思不要最后一步高速离心 以免损失膜蛋白 总觉得这样做心里没底 求助前线战友们的意见
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【空】
1楼 2012-10-24 14:50:52
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

现在很多公司都有专门的提取膜蛋白的试剂，你可以尝试一下，不推荐哪个品牌了，以免有宣传的嫌疑
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2楼2012-10-29 15:09:38
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你老师说的有道理，但不妨试试膜蛋白提取试剂盒
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不是風動，亦非幡動，仁者心動
3楼2012-10-30 10:18:52
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seasonin

银虫 (小有名气)
同问 同问 我也要从膜上找蛋白受体 最后你的膜蛋白提到了吗？还是用总蛋白做的免疫共沉淀呢？
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4楼2013-12-18 10:44:31
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田间花儿

新虫 (初入文坛)
楼主，我也要做膜蛋白，是心肌细胞上的，你怎么做的，最后买试剂盒了吗？哪家公司？
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5楼2014-02-13 21:42:21
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

细胞裂解后细胞膜及其上面的蛋白悬浮在上层，离心后的渣滓主要是细胞核之类的充分。
如果不离心，就超声处理，减少渣滓。用数细胞的方式定量。
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6楼2014-02-14 11:13:42
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treetreew

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实如果你选用hepa强的裂解液，基本上就没啥碎片了，高速离心也就没啥作用了，全都用了都没事儿。
总蛋白里面的膜蛋白也是有的，当然不如kit富集的集中。
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7楼2014-02-14 13:31:56
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