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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T-RFLP技术中，真菌的PCR问题
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

[求助] T-RFLP技术中，真菌的PCR问题已有1人参与

T-RFLP技术中，大家真菌PCR都用的什么引物啊，我用的ITS1F/ITS4,一直都P不出来，要不是弥散状的条带，要不是二聚体，能参考一下大家的的体系和程序吗？我做的是土壤真菌的，不胜感激！
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1楼2012-09-02 08:43:57
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
谢谢你啊
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2楼2012-09-02 09:27:16
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
怎么么有回答的呀，
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3楼2012-09-02 09:28:42
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jmlilan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也在做这个东西，提出来的DNA做细菌的PCR很容易就能P出来，换上这对引物P真菌就一直呈弥散状，体系条件全都优化了，还是没P出来，希望有大侠指导
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4楼2012-09-13 16:35:36
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jmlilan at 2012-09-13 16:35:36
我也在做这个东西，提出来的DNA做细菌的PCR很容易就能P出来，换上这对引物P真菌就一直呈弥散状，体系条件全都优化了，还是没P出来，希望有大侠指导

我之前有一段时间是有目的条带出现的，但是上下都有拖带，再调条件的话就又成弥散状的带了，我把酶什么的都换了还是不行，之前是用的镁离子分装的，后来又换成不分装的了，都不行，你现在能P才出来吗
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5楼2012-10-03 10:28:46
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jmlilan

新虫 (初入文坛)
★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-08 13:39:57
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5楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-10-03 10:28:46
我之前有一段时间是有目的条带出现的，但是上下都有拖带，再调条件的话就又成弥散状的带了，我把酶什么的都换了还是不行，之前是用的镁离子分装的，后来又换成不分装的了，都不行，你现在能P才出来吗...

我前两天换了个体系P出来了两次，也和你的情况差不多，目的条带还可以但是有非特异性条带、引物二聚体和拖尾。我再P就P不出来了，要么是弥散状要么是只有二聚体，很郁闷。能参考下你之前P出来的体系和条件吗
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6楼2012-11-08 09:25:06
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jmlilan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-10-03 10:28:46
我之前有一段时间是有目的条带出现的，但是上下都有拖带，再调条件的话就又成弥散状的带了，我把酶什么的都换了还是不行，之前是用的镁离子分装的，后来又换成不分装的了，都不行，你现在能P才出来吗...

我前两天换了个体系P出来了两次，也和你的情况差不多，目的条带还可以但是有非特异性条带、引物二聚体和拖尾。我再P就P不出来了，要么是弥散状要么是只有二聚体，很郁闷。能参考下你之前P出来的体系和条件吗
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7楼2012-11-08 09:25:42
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jmlilan at 2012-11-08 09:25:06
我前两天换了个体系P出来了两次，也和你的情况差不多，目的条带还可以但是有非特异性条带、引物二聚体和拖尾。我再P就P不出来了，要么是弥散状要么是只有二聚体，很郁闷。能参考下你之前P出来的体系和条件吗...

不好意思啊，我刚看到，我明天给你发我的那个体系，那个也只是有目的条带，但是上下都有拖带的，不知道能不能帮到你
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8楼2012-11-12 20:26:23
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-11-12 20:26:23
不好意思啊，我刚看到，我明天给你发我的那个体系，那个也只是有目的条带，但是上下都有拖带的，不知道能不能帮到你...

我用的是这个体系和程序，但是上下也是有拖带的，只是目的条带还是有的，你参考一下吧，用的是天根的酶和dNTPs，buffer：5，镁离子：4，dNTPs：4，Primer：1*2，DNA：3，Taq0.8，水：31.2;94度：7min，（94度：1min，56度：1min，72度：1.5min）30个循环，72度：5min
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9楼2012-11-13 08:58:42
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jmlilan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-11-14 16:24:41
我之前用的康为的PCRmix 12.5ul mix， 引物1.5ul ，DNA各1ul，1ul BSA，水7.5ul
条件：94度 5min,94  1min ，55 45s，72  1min，32循环，72  10min
P出来过两次，有二聚体和非特异性条带，但是目的条带还是很不错的（没法上图片，遗憾），但重复不出来了，你也可以试试
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10楼2012-11-14 09:35:36
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