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jerryzyy

金虫 (小有名气)

[求助] T-RFLP技术中,真菌的PCR问题 已有1人参与

T-RFLP技术中,大家真菌PCR都用的什么引物啊,我用的ITS1F/ITS4,一直都P不出来,要不是弥散状的条带,要不是二聚体,能参考一下大家的的体系和程序吗?我做的是土壤真菌的,不胜感激!
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

谢谢你啊
2楼2012-09-02 09:27:16
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

怎么么有回答的呀,
3楼2012-09-02 09:28:42
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jmlilan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也在做这个东西,提出来的DNA做细菌的PCR很容易就能P出来,换上这对引物P真菌就一直呈弥散状,体系条件全都优化了,还是没P出来,希望有大侠指导
4楼2012-09-13 16:35:36
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jmlilan at 2012-09-13 16:35:36
我也在做这个东西,提出来的DNA做细菌的PCR很容易就能P出来,换上这对引物P真菌就一直呈弥散状,体系条件全都优化了,还是没P出来,希望有大侠指导

我之前有一段时间是有目的条带出现的,但是上下都有拖带,再调条件的话就又成弥散状的带了,我把酶什么的都换了还是不行,之前是用的镁离子分装的,后来又换成不分装的了,都不行,你现在能P才出来吗
5楼2012-10-03 10:28:46
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jmlilan

新虫 (初入文坛)


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-08 13:39:57
引用回帖:
5楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-10-03 10:28:46
我之前有一段时间是有目的条带出现的,但是上下都有拖带,再调条件的话就又成弥散状的带了,我把酶什么的都换了还是不行,之前是用的镁离子分装的,后来又换成不分装的了,都不行,你现在能P才出来吗...

我前两天换了个体系P出来了两次,也和你的情况差不多,目的条带还可以但是有非特异性条带、引物二聚体和拖尾。我再P就P不出来了,要么是弥散状要么是只有二聚体,很郁闷。能参考下你之前P出来的体系和条件吗
6楼2012-11-08 09:25:06
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jmlilan

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-10-03 10:28:46
我之前有一段时间是有目的条带出现的,但是上下都有拖带,再调条件的话就又成弥散状的带了,我把酶什么的都换了还是不行,之前是用的镁离子分装的,后来又换成不分装的了,都不行,你现在能P才出来吗...

我前两天换了个体系P出来了两次,也和你的情况差不多,目的条带还可以但是有非特异性条带、引物二聚体和拖尾。我再P就P不出来了,要么是弥散状要么是只有二聚体,很郁闷。能参考下你之前P出来的体系和条件吗
7楼2012-11-08 09:25:42
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by jmlilan at 2012-11-08 09:25:06
我前两天换了个体系P出来了两次,也和你的情况差不多,目的条带还可以但是有非特异性条带、引物二聚体和拖尾。我再P就P不出来了,要么是弥散状要么是只有二聚体,很郁闷。能参考下你之前P出来的体系和条件吗...

不好意思啊,我刚看到,我明天给你发我的那个体系,那个也只是有目的条带,但是上下都有拖带的,不知道能不能帮到你
8楼2012-11-12 20:26:23
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jerryzyy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-11-12 20:26:23
不好意思啊,我刚看到,我明天给你发我的那个体系,那个也只是有目的条带,但是上下都有拖带的,不知道能不能帮到你...

我用的是这个体系和程序,但是上下也是有拖带的,只是目的条带还是有的,你参考一下吧,用的是天根的酶和dNTPs,buffer:5,镁离子:4,dNTPs:4,Primer:1*2,DNA:3,Taq0.8,水:31.2;94度:7min,(94度:1min,56度:1min,72度:1.5min)30个循环,72度:5min
9楼2012-11-13 08:58:42
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jmlilan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-11-14 16:24:41
我之前用的康为的PCRmix 12.5ul mix, 引物1.5ul ,DNA各1ul,1ul BSA,水7.5ul
条件:94度 5min,94  1min ,55 45s,72  1min,32循环,72  10min
P出来过两次,有二聚体和非特异性条带,但是目的条带还是很不错的(没法上图片,遗憾),但重复不出来了,你也可以试试
10楼2012-11-14 09:35:36
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