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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 新手入门，想问一下关于未知基因的表达
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zdwxxw

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 新手入门，想问一下关于未知基因的表达

如题，如果我知道一株菌有某种功能，但是相关的基因却没有报道过，如何才能把这个基因找出来克隆至模式菌株中表达？ 新手入门，谢谢各位指教！
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基因克隆与表达

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1楼 2012-08-28 14:16:35
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sketch

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zdwxxw: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-08-28 20:25:43
通过文献知道这种功能的代谢途径，即确定是表达了哪个基因→在NCBI上查找此菌的其他亚类的此基因基因序列，通过对比序列设计引物（有可能是兼并引物）→提取此菌基因组，通过pcr获得基因→与T载体连接，转化入模式菌种→提出质粒，测序→测序结果正确后，转化入表达菌种。

这是一般流程，你要具体说明一下你的情况。
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2楼2012-08-28 15:26:30
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zdwxxw

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sketch at 2012-08-28 15:26:30
通过文献知道这种功能的代谢途径，即确定是表达了哪个基因→在NCBI上查找此菌的其他亚类的此基因基因序列，通过对比序列设计引物（有可能是兼并引物）→提取此菌基因组，通过pcr获得基因→与T载体连接，转化入模式菌 ...

情况是这样的，我正在查找课题，我想筛一株产酶的菌，然后将其产酶基因进行克隆并高效表达。但是这方面的研究比较少，只有少数几种菌的产酶基因被报道过，如果报道过的还好；我怕筛出来其他的菌种，那样该怎么办呢？  不知道表达的清不清楚
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3楼2012-08-28 20:31:17
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sketch

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zdwxxw: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢了，很有帮助，可能以后还会有什么问题，到时再打搅您，请不吝赐教！再次表示感谢！ 2012-08-28 21:31:49
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-08-29 07:45:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by zdwxxw at 2012-08-28 20:31:17
情况是这样的，我正在查找课题，我想筛一株产酶的菌，然后将其产酶基因进行克隆并高效表达。但是这方面的研究比较少，只有少数几种菌的产酶基因被报道过，如果报道过的还好；我怕筛出来其他的菌种，那样该怎么办呢 ...

可以的。研究得少的东西容易出成果。我现在能想到的有两种方法：
当然，最先要做的是把这种菌株筛出来，因为一般的菌株并不会过量产一种酶，或者表达这种酶的高活性。如果你通过诱变甚至定向进化的方法，可能是①解除其调控，使酶过量表达；②酶活提高，酶学性质也提高了。如果是①的情况，该酶本身的性质可能并没有改变，只是调控限制被解除了，但是做克隆表达也是可以尝试的；如果是②的情况，说明酶的基因改变导致内部结构发生改变，这种酶做克隆表达是很有价值的。但我认为，无论哪种情况，都可以做克隆表达。然后怎样获得该酶基因，大概我知道的有两种：
（1）我上面所说的，你可以分析一下“少数几种菌的产酶基因被报道过”的这些菌株中，该酶基因的一致程度，如果基因前面几十个碱基和最后几十个碱基是相似的，则可以根据这些序列设计（兼并）引物，以你筛出的菌的基因组为模版进行pcr调出基因。后面的操作是很模式化的（不同实验室有区别），pcr得到目的基因→胶回收→加A→纯化→连接T载体→转化JM109→保藏甘油管、提质粒、质粒测序→转化表达载体→发酵做酶学性质分析。

（2）如果你不知道基因，则需要将蛋白纯化出来，测定蛋白N端、C端蛋白质序列，根据序列设计兼并引物，按（1）的步骤调取基因。

应该还有其他方法，你可以看看分子生物学的教材，看别人用什么方法调基因。
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4楼2012-08-28 21:25:19
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sketch

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
zdwxxw: 金币+10, ★有帮助, 多谢，有劳了！ 2012-08-28 21:33:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by zdwxxw at 2012-08-28 20:31:17
情况是这样的，我正在查找课题，我想筛一株产酶的菌，然后将其产酶基因进行克隆并高效表达。但是这方面的研究比较少，只有少数几种菌的产酶基因被报道过，如果报道过的还好；我怕筛出来其他的菌种，那样该怎么办呢 ...

筛出来其他菌株没有关系，到时候可以做一个16sRNA鉴定菌株，然后一般的菌ncbi上都能找到基因组，而且里面很多基因都是注释了的，一般能找到你的那种酶对应的基因，这样就可以Pcr把基因调出来了。
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5楼2012-08-28 21:30:51
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sketch

木虫 (正式写手)
好的，不过我也有个疑问，你一直呆在论坛上吗？怎么会这么快就看到回复呢？有提示音吗？而且你注册时间这么短，怎么会这么多金币啊？呵呵。传授经验啊~~
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6楼2012-08-28 21:34:40
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
我觉得你可以直接克隆到这条基因的，可以采用宏基因组学技术中类似的方法，将这个菌株的基因组提取出来，构建小片段的基因组文库，在根据功能筛选获得你的基因，直接测序就可以了
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zdwxxw
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
7楼2012-08-30 21:11:09
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zdwxxw

至尊木虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-08-30 21:11:09
我觉得你可以直接克隆到这条基因的，可以采用宏基因组学技术中类似的方法，将这个菌株的基因组提取出来，构建小片段的基因组文库，在根据功能筛选获得你的基因，直接测序就可以了

不好意思哈，想追加10个金币给你的，可惜不是应助，给不了。不过你说的构建cDNA文库确实是一个方法，谢谢了！
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踏踏实实做好自己，其他的事与你无关。
8楼2012-08-31 14:47:52
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by zdwxxw at 2012-08-31 14:47:52
不好意思哈，想追加10个金币给你的，可惜不是应助，给不了。不过你说的构建cDNA文库确实是一个方法，谢谢了！...

不客气，我觉得不是真核生物的话，直接构建DNA文库，更方便一些
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
9楼2012-08-31 18:41:04
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