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【答案】应助回帖

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zdwxxw: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢了,很有帮助,可能以后还会有什么问题,到时再打搅您,请不吝赐教!再次表示感谢! 2012-08-28 21:31:49
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-08-29 07:45:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by zdwxxw at 2012-08-28 20:31:17
情况是这样的,我正在查找课题,我想筛一株产酶的菌,然后将其产酶基因进行克隆并高效表达。但是这方面的研究比较少,只有少数几种菌的产酶基因被报道过,如果报道过的还好;我怕筛出来其他的菌种,那样该怎么办呢 ...

可以的。研究得少的东西容易出成果。我现在能想到的有两种方法:
当然,最先要做的是把这种菌株筛出来,因为一般的菌株并不会过量产一种酶,或者表达这种酶的高活性。如果你通过诱变甚至定向进化的方法,可能是①解除其调控,使酶过量表达;②酶活提高,酶学性质也提高了。如果是①的情况,该酶本身的性质可能并没有改变,只是调控限制被解除了,但是做克隆表达也是可以尝试的;如果是②的情况,说明酶的基因改变导致内部结构发生改变,这种酶做克隆表达是很有价值的。但我认为,无论哪种情况,都可以做克隆表达。然后怎样获得该酶基因,大概我知道的有两种:
(1)我上面所说的,你可以分析一下“少数几种菌的产酶基因被报道过”的这些菌株中,该酶基因的一致程度,如果基因前面几十个碱基和最后几十个碱基是相似的,则可以根据这些序列设计(兼并)引物,以你筛出的菌的基因组为模版进行pcr调出基因。后面的操作是很模式化的(不同实验室有区别),pcr得到目的基因→胶回收→加A→纯化→连接T载体→转化JM109→保藏甘油管、提质粒、质粒测序→转化表达载体→发酵做酶学性质分析。

(2)如果你不知道基因,则需要将蛋白纯化出来,测定蛋白N端、C端蛋白质序列,根据序列设计兼并引物,按(1)的步骤调取基因。

应该还有其他方法,你可以看看分子生物学的教材,看别人用什么方法调基因。
4楼2012-08-28 21:25:19
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