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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 新手入门，想问一下关于未知基因的表达
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【答案】应助回帖

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zdwxxw: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢了，很有帮助，可能以后还会有什么问题，到时再打搅您，请不吝赐教！再次表示感谢！ 2012-08-28 21:31:49
rainwander: MicEPI+1, 鼓励交流 2012-08-29 07:45:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by zdwxxw at 2012-08-28 20:31:17
情况是这样的，我正在查找课题，我想筛一株产酶的菌，然后将其产酶基因进行克隆并高效表达。但是这方面的研究比较少，只有少数几种菌的产酶基因被报道过，如果报道过的还好；我怕筛出来其他的菌种，那样该怎么办呢 ...

可以的。研究得少的东西容易出成果。我现在能想到的有两种方法：
当然，最先要做的是把这种菌株筛出来，因为一般的菌株并不会过量产一种酶，或者表达这种酶的高活性。如果你通过诱变甚至定向进化的方法，可能是①解除其调控，使酶过量表达；②酶活提高，酶学性质也提高了。如果是①的情况，该酶本身的性质可能并没有改变，只是调控限制被解除了，但是做克隆表达也是可以尝试的；如果是②的情况，说明酶的基因改变导致内部结构发生改变，这种酶做克隆表达是很有价值的。但我认为，无论哪种情况，都可以做克隆表达。然后怎样获得该酶基因，大概我知道的有两种：
（1）我上面所说的，你可以分析一下“少数几种菌的产酶基因被报道过”的这些菌株中，该酶基因的一致程度，如果基因前面几十个碱基和最后几十个碱基是相似的，则可以根据这些序列设计（兼并）引物，以你筛出的菌的基因组为模版进行pcr调出基因。后面的操作是很模式化的（不同实验室有区别），pcr得到目的基因→胶回收→加A→纯化→连接T载体→转化JM109→保藏甘油管、提质粒、质粒测序→转化表达载体→发酵做酶学性质分析。

（2）如果你不知道基因，则需要将蛋白纯化出来，测定蛋白N端、C端蛋白质序列，根据序列设计兼并引物，按（1）的步骤调取基因。

应该还有其他方法，你可以看看分子生物学的教材，看别人用什么方法调基因。
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4楼2012-08-28 21:25:19
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