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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 关于酶切表达载体的问题
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 关于酶切表达载体的问题

各位大侠：
    表达载体是4547碱基，其上的两个酶切位点之间相差40个碱基，本来是应该切掉这40个碱基，，可是每次切都有1000处有一条带  然后还有一个4000多的条带
载体是老板给的   图谱是从一篇文献上找的 根据图谱设计的酶切位点   能不能大家帮忙分析一下原因
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1楼 2012-08-14 21:48:12
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woshizhufeng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
文献上的没切位点是不是不全啊，你在仔细找找其他的文章，看有没有其他的酶切位点。
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2楼2012-08-15 08:42:16
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sl35537417

木虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-15 15:31:34
1.载体本身不对  或者 图谱不对
2.酶有问题 或者酶切反应体系有问题 导致星号活性
3.有可能你得到的载体不是空载体  有可能连有别的片段
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3楼2012-08-15 09:12:41
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sky_fly

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以根据质粒序列设计多个引物，进行测序，看看序列对不对，不过很多时候可能都是酶切时间太长造成的错切
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绝望越大，突破就越大
4楼2012-08-21 10:38:34
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-21 16:21:07
个人建议：
1.确定你选择的酶切位点是单克隆位点；
2.双酶切的时候buffer要选择好，而且要知道酶有没有星活性；
3.确定载体是空载体。
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5楼2012-08-21 12:03:56
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sky_fly at 2012-08-21 10:38:34
可以根据质粒序列设计多个引物，进行测序，看看序列对不对，不过很多时候可能都是酶切时间太长造成的错切

只切一个小时也是同样的效果么关键是
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6楼2012-09-05 09:25:23
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励积极交流经验 2012-09-05 14:00:10
大阪市由于该载体资料不全，导致你对载体酶切位点分析有误造成的，你所用的酶切位点在载体上应该有两个，建议这样：
1 在谷歌上输入该载体的全名，后面一个空格输入sequence一般都能查到商品化载体序列，然后用DNAMAN或者BIOXM等分子生物学软件分析酶切位点，全面检查一下是否有重复的酶切位点。
2 考虑内切酶的污染和质量，如果你们实验室的内切酶是公用的，就要考虑是否别人在做双酶切的时候污染了其他内切酶，导致酶切条带有误，另外内切酶牌子的选择也是有讲究的，NEB的一般保真性和效率最好，性活性概率最低甚至没有，MBI和TAKARA的就要选择好BUFFER，否则时间长会有星活性，但是就你的实验来看，星活性概率不大，毕竟酶切时间很短。
一般你这种情况就是上述两种可能，一一排除吧。
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7楼2012-09-05 11:06:28
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-05 11:06:28
大阪市由于该载体资料不全，导致你对载体酶切位点分析有误造成的，你所用的酶切位点在载体上应该有两个，建议这样：
1 在谷歌上输入该载体的全名，后面一个空格输入sequence一般都能查到商品化载体序列，然后用DNA ...

嗯  很感谢
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8楼2012-09-05 16:22:27
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