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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落，其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有，拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了，好急啊，请高手指点！


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His，结果是一样的，每次转化后都有菌落长出来，但是就是鉴定不出来我自己的目的片段，好郁闷
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1楼 2012-08-01 11:40:36
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luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题，貌似用普通转化（热激转化）好一些。
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2楼2012-08-01 16:02:59
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。
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3楼2012-08-01 20:44:48
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题，你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看，是否是你需要的片段。
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4楼2012-08-01 23:07:10
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-01 20:44:48
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。

我是PCR产物直接酶切会受到饿，今天做出来了一个PET-28a，但是检测了20多个才有这么一个阳性的转化子，不知道为什么效率那么低。同时我做的其它的载体还没有检测到阳性，很郁闷。特别是我的PCR检测总是没有条带，量阳性对照液跑不出来，但是酶切可以鉴定出来是我的目的条带的地方有条带，所以我每鉴定一个转化子就要提一个质粒，做一次酶切，好郁闷。有没有好的意见给我，谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2012-08-03 14:49:51
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+5 2012-08-04 14:20:38
475502411: 金币+6 2012-08-21 13:16:33
引用回帖:
5楼: Originally posted by 475502411 at 2012-08-03 14:49:51
我是PCR产物直接酶切会受到饿，今天做出来了一个PET-28a，但是检测了20多个才有这么一个阳性的转化子，不知道为什么效率那么低。同时我做的其它的载体还没有检测到阳性，很郁闷。特别是我的PCR检测总是没有条带，量 ...

以前做表达，为了确保编码无突变，总是先克隆到载体上，测序确认后再切下回收连接，效率很高。想问一下，你的PCR产物直接酶切，是利用引物引入酶切位点吗？是否加了保护碱基？这对产物的酶切效率是有影响的。也可能是这方面的原因。如果没有保护碱基，建议先克隆到载体上后，再导入pet28载体。祝顺利！
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6楼2012-08-03 20:49:11
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-04 13:57:07
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:26:02
475502411: 金币+2 2012-08-21 13:15:31
"其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有",菌液pcr和酶切是必须的呀，这样可以更好的筛选阳性克隆，我以前也做过这种情况，祝你好运。
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coasttocoast。
7楼2012-08-04 08:33:31
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-04 13:57:17
475502411: 金币+3 2012-08-04 14:25:47
你的目的片段是PCR扩增出来的吗？有没有拖带现象，带弱不弱？我觉得很有可能是你产物没有回收到，也就是你没有把你的目的片段得到，所以你后来做的酶切、连接的都不是你的目的带，导致酶切质粒鉴定时切不出你的目的条带。如果送测序的话，估计会测出比你目的基因多一些的碱基。顺便问问，是不是酶切出的目的带比你的680bp大些呢？仅供参考！
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实验顺利！！
8楼2012-08-04 10:07:10
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-03 20:49:11
以前做表达，为了确保编码无突变，总是先克隆到载体上，测序确认后再切下回收连接，效率很高。想问一下，你的PCR产物直接酶切，是利用引物引入酶切位点吗？是否加了保护碱基？这对产物的酶切效率是有影响的。也可能 ...

是引物上的酶切位点，加了保护碱基了，一个2个碱基，一个3个碱基
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9楼2012-08-04 14:20:24
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ankang0910 at 2012-08-04 10:07:10
你的目的片段是PCR扩增出来的吗？有没有拖带现象，带弱不弱？我觉得很有可能是你产物没有回收到，也就是你没有把你的目的片段得到，所以你后来做的酶切、连接的都不是你的目的带，导致酶切质粒鉴定时切不出你的目的 ...

1.我的目的条带是PCR扩增出来的，当时没有看，直接回收的，但回收完有拖带
2.酶切得到的是不是比680bp大，没看出来，测序结果还没出来
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10楼2012-08-04 14:25:38
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