应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
151/2返回列表12下一页
查看: 1153  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落，其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有，拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了，好急啊，请高手指点！


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His，结果是一样的，每次转化后都有菌落长出来，但是就是鉴定不出来我自己的目的片段，好郁闷
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-08-01 11:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题，貌似用普通转化（热激转化）好一些。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-01 16:02:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-01 20:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题，你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看，是否是你需要的片段。
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-01 23:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-01 20:44:48
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。

我是PCR产物直接酶切会受到饿，今天做出来了一个PET-28a，但是检测了20多个才有这么一个阳性的转化子，不知道为什么效率那么低。同时我做的其它的载体还没有检测到阳性，很郁闷。特别是我的PCR检测总是没有条带，量阳性对照液跑不出来，但是酶切可以鉴定出来是我的目的条带的地方有条带，所以我每鉴定一个转化子就要提一个质粒，做一次酶切，好郁闷。有没有好的意见给我，谢谢
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2012-08-03 14:49:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+5 2012-08-04 14:20:38
475502411: 金币+6 2012-08-21 13:16:33
引用回帖:
5楼: Originally posted by 475502411 at 2012-08-03 14:49:51
我是PCR产物直接酶切会受到饿，今天做出来了一个PET-28a，但是检测了20多个才有这么一个阳性的转化子，不知道为什么效率那么低。同时我做的其它的载体还没有检测到阳性，很郁闷。特别是我的PCR检测总是没有条带，量 ...

以前做表达，为了确保编码无突变，总是先克隆到载体上，测序确认后再切下回收连接，效率很高。想问一下，你的PCR产物直接酶切，是利用引物引入酶切位点吗？是否加了保护碱基？这对产物的酶切效率是有影响的。也可能是这方面的原因。如果没有保护碱基，建议先克隆到载体上后，再导入pet28载体。祝顺利！
赞一下 回复此楼
6楼2012-08-03 20:49:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-04 13:57:07
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:26:02
475502411: 金币+2 2012-08-21 13:15:31
"其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有",菌液pcr和酶切是必须的呀，这样可以更好的筛选阳性克隆，我以前也做过这种情况，祝你好运。
赞一下 回复此楼
coasttocoast。
7楼2012-08-04 08:33:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-04 13:57:17
475502411: 金币+3 2012-08-04 14:25:47
你的目的片段是PCR扩增出来的吗？有没有拖带现象，带弱不弱？我觉得很有可能是你产物没有回收到，也就是你没有把你的目的片段得到，所以你后来做的酶切、连接的都不是你的目的带，导致酶切质粒鉴定时切不出你的目的条带。如果送测序的话，估计会测出比你目的基因多一些的碱基。顺便问问，是不是酶切出的目的带比你的680bp大些呢？仅供参考！
赞一下 回复此楼
实验顺利！！
8楼2012-08-04 10:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-03 20:49:11
以前做表达，为了确保编码无突变，总是先克隆到载体上，测序确认后再切下回收连接，效率很高。想问一下，你的PCR产物直接酶切，是利用引物引入酶切位点吗？是否加了保护碱基？这对产物的酶切效率是有影响的。也可能 ...

是引物上的酶切位点，加了保护碱基了，一个2个碱基，一个3个碱基
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
9楼2012-08-04 14:20:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ankang0910 at 2012-08-04 10:07:10
你的目的片段是PCR扩增出来的吗？有没有拖带现象，带弱不弱？我觉得很有可能是你产物没有回收到，也就是你没有把你的目的片段得到，所以你后来做的酶切、连接的都不是你的目的带，导致酶切质粒鉴定时切不出你的目的 ...

1.我的目的条带是PCR扩增出来的，当时没有看，直接回收的，但回收完有拖带
2.酶切得到的是不是比680bp大，没看出来，测序结果还没出来
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
10楼2012-08-04 14:25:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 475502411 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 291 求调剂 +6 化工2026届毕业� 2026-03-21 7/350 2026-03-26 02:14 by BruceLiu320
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +8 Mr. Z 2026-03-25 8/400 2026-03-25 23:00 by peike
[考研] 考研调剂 +6 呼呼？~+123456 2026-03-24 6/300 2026-03-25 22:55 by 418490947
[考研] 0854电子信息求调剂 +7 α____ 2026-03-22 9/450 2026-03-25 13:37 by α____
[考研] 080500求调剂 +3 zzzzfan 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:38 by barlinike
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考博] 申博26年 +4 八6八68 2026-03-19 4/200 2026-03-24 15:49 by 小Ben呵呵
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 一志愿北京化工大学 070300 学硕 336分 求调剂 +7 vv迷 2026-03-22 7/350 2026-03-23 23:44 by Txy@872106
[考研] 336求调剂 +4 收到VS 2026-03-20 4/200 2026-03-23 19:02 by macy2011
[考研] 263求调剂 +6 yqdszhdap－ 2026-03-22 9/450 2026-03-23 12:57 by yqdszhdap－
[考研] 070300，一志愿北航320求调剂 +3 Jerry0216 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:16 by 。。堂堂
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +5 困困困困坤坤 2026-03-20 6/300 2026-03-22 17:41 by hxsm
[考研] 求调剂院校信息 +6 CX 330 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:25 by 无懈可击111
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-20 3/150 2026-03-22 14:46 by ColorlessPI
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 初试 317 +7 半拉月丙 2026-03-20 7/350 2026-03-21 22:26 by peike
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] 086500 325 求调剂 +3 领带小熊 2026-03-19 3/150 2026-03-20 18:38 by 尽舜尧1
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭