应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
51/1返回列表
查看: 1308  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落，其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有，拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了，好急啊，请高手指点！


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His，结果是一样的，每次转化后都有菌落长出来，但是就是鉴定不出来我自己的目的片段，好郁闷
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-08-01 11:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-03 20:49:11
以前做表达，为了确保编码无突变，总是先克隆到载体上，测序确认后再切下回收连接，效率很高。想问一下，你的PCR产物直接酶切，是利用引物引入酶切位点吗？是否加了保护碱基？这对产物的酶切效率是有影响的。也可能 ...

是引物上的酶切位点，加了保护碱基了，一个2个碱基，一个3个碱基
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
9楼2012-08-04 14:20:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题，貌似用普通转化（热激转化）好一些。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-01 16:02:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-01 20:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题，你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看，是否是你需要的片段。
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-01 23:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:51 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:29 by jCd0dEvKHShX
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-29 11:17 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +3 349506619 2026-08-28 3/150 2026-08-29 10:49 by 木风9012
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 10:18 by winsaint
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 09:26 by G6APbkg8SA6w
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭