应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
51/1返回列表
查看: 1154  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落，其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有，拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了，好急啊，请高手指点！


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His，结果是一样的，每次转化后都有菌落长出来，但是就是鉴定不出来我自己的目的片段，好郁闷
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-08-01 11:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题，你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看，是否是你需要的片段。
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-01 23:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题，貌似用普通转化（热激转化）好一些。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-01 16:02:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-01 20:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-01 20:44:48
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。

我是PCR产物直接酶切会受到饿，今天做出来了一个PET-28a，但是检测了20多个才有这么一个阳性的转化子，不知道为什么效率那么低。同时我做的其它的载体还没有检测到阳性，很郁闷。特别是我的PCR检测总是没有条带，量阳性对照液跑不出来，但是酶切可以鉴定出来是我的目的条带的地方有条带，所以我每鉴定一个转化子就要提一个质粒，做一次酶切，好郁闷。有没有好的意见给我，谢谢
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2012-08-03 14:49:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 调剂310 +3 温柔的晚安 2026-03-25 4/200 2026-03-25 23:16 by peike
[考研] 材料与化工328分调剂 +6 。，。，。，。i 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 335分 | 材料与化工专硕 | GPA 4.07 | 有科研经历 +6 cccchenso 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:25 by 544594351
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 281求调剂 +4 Koxui 2026-03-24 5/250 2026-03-25 11:38 by userper
[考研] 318求调剂 +3 plum李子 2026-03-23 3/150 2026-03-25 09:42 by 雾散后相遇lc
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +15 吃吃吃才有意义 2026-03-19 16/800 2026-03-24 19:51 by 了了了了。。
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 291求调剂 +3 HanBeiNingZC 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:34 by barlinike
[考研] 307求调剂 +3 余意卿 2026-03-21 6/300 2026-03-24 15:03 by 余意卿
[考博] 26申博自荐 +3 whh869393 2026-03-24 3/150 2026-03-24 09:55 by 21018060
[考研] 求调剂 +7 十三加油 2026-03-21 7/350 2026-03-23 23:48 by 热情沙漠
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 284求调剂 +3 yanzhixue111 2026-03-23 6/300 2026-03-23 22:58 by pswait
[考研] 化学308分求调剂 +3 你好明天你好 2026-03-23 3/150 2026-03-23 20:11 by macy2011
[考研] 276求调剂 +3 YNRYG 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:31 by 醉在风里
[考研] 298求调剂一志愿211 +3 上岸6666@ 2026-03-20 3/150 2026-03-22 15:50 by ColorlessPI
[考研] 一志愿北京化工大学070300 学硕336求调剂 +5 vv迷 2026-03-21 8/400 2026-03-22 14:20 by ColorlessPI
[考研] 296求调剂 +4 www_q 2026-03-20 4/200 2026-03-21 17:26 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭