应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
51/1返回列表
查看: 1321  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落，其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有，拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了，好急啊，请高手指点！


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His，结果是一样的，每次转化后都有菌落长出来，但是就是鉴定不出来我自己的目的片段，好郁闷
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-08-01 11:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金币+5 2012-08-04 14:20:38
475502411: 金币+6 2012-08-21 13:16:33
引用回帖:
5楼: Originally posted by 475502411 at 2012-08-03 14:49:51
我是PCR产物直接酶切会受到饿，今天做出来了一个PET-28a，但是检测了20多个才有这么一个阳性的转化子，不知道为什么效率那么低。同时我做的其它的载体还没有检测到阳性，很郁闷。特别是我的PCR检测总是没有条带，量 ...

以前做表达，为了确保编码无突变，总是先克隆到载体上，测序确认后再切下回收连接，效率很高。想问一下，你的PCR产物直接酶切，是利用引物引入酶切位点吗？是否加了保护碱基？这对产物的酶切效率是有影响的。也可能是这方面的原因。如果没有保护碱基，建议先克隆到载体上后，再导入pet28载体。祝顺利！
赞一下 回复此楼
6楼2012-08-03 20:49:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题，貌似用普通转化（热激转化）好一些。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-01 16:02:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-01 20:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题，你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看，是否是你需要的片段。
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-01 23:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:39 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:17 by ZPa0EcMwuECS
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 06:46 by ZPa0EcMwuECS
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 05:48 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 13/650 2026-08-30 05:38 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 03:26 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 02:09 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 01:36 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-30 00:52 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +5 德尚中行 2026-08-27 6/300 2026-08-29 18:10 by manplx
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +9 苏东坡二世 2026-08-23 9/450 2026-08-29 14:41 by hustersqt
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +5 gdd2018 2026-08-28 10/500 2026-08-29 14:10 by Jacob678
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭