应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
51/1返回列表
查看: 1320  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a，目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落，其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有，拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了，好急啊，请高手指点！


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His，结果是一样的，每次转化后都有菌落长出来，但是就是鉴定不出来我自己的目的片段，好郁闷
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2012-08-01 11:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-04 13:57:07
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:26:02
475502411: 金币+2 2012-08-21 13:15:31
"其中一次做了阴性对照和感受态对照，结果只有转化连接产物的长了，但PCR和酶切鉴定都没有",菌液pcr和酶切是必须的呀，这样可以更好的筛选阳性克隆，我以前也做过这种情况，祝你好运。
赞一下 回复此楼
coasttocoast。
7楼2012-08-04 08:33:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题，貌似用普通转化（热激转化）好一些。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-01 16:02:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建，用的是热激转化。遇到这种情况，先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物？先确认酶切位点没有问题，双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照，确认感受态和连接酶没有问题。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-01 20:44:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题，你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看，是否是你需要的片段。
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-01 23:07:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:33 by 4qO8zhfjr2AX
[公派出国] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 17:30 by 4FFAWE8HcgUD
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +4 tannykie 2026-08-29 4/200 2026-08-29 17:14 by lmz0216
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 14:13 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:51 by jCd0dEvKHShX
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:40 by jCd0dEvKHShX
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:29 by jCd0dEvKHShX
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 11:18 by jCd0dEvKHShX
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 09:26 by G6APbkg8SA6w
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭