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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 电泳条带很淡，能用于割胶回收吗
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栀子花1120

新虫 (初入文坛)

[求助] 电泳条带很淡，能用于割胶回收吗

我的电泳图条带很暗，我想做割胶回收，不知道条带淡了，做回收有没有意义？

还有请高人分析一下为什么我的电泳条带会这么淡啊  ，我的DNA用的是试剂盒提的，浓度比较低，只有20~30ng/ul.但是配50ul的体系时，我加了4ul。应该怎样改善，才能得到比较好的条带呢，O(∩_∩)O谢谢了
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1楼 2012-07-13 13:47:42
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 欢迎交流经验 2012-07-16 15:24:12
首先可以肯定电泳条带较淡，仍然是可以回收的。
根据情况给你一下个人建议：
对于提质粒：
buffer 2处理时间久一些，2min为宜。Washing buffer只洗脱一次。加Elution buffer后将柱子放于60度2min，高速离心洗脱。可以有效提高提得质粒浓度。
对于PCR：
可以适当增加1-5个循环。增加PCR管数。降低退火温度。利用PCR产物，稀释（50、100、200）倍后做模版再做PCR。
对于胶回收：
割胶后加入buffer 60度溶胶后一定冰浴2min（增加DNA与柱子的结合率）。加Elution buffer后将柱子放于60度2min，高速离心洗脱。
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栀子花1120
6楼2012-07-16 14:37:57
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
栀子花1120: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-13 15:38:02
1、改善DNA提取方法：如加大样品量、研磨充分等。
2、改变PCR条件，提高扩增效率。
3、实在懒得做前两项的话，多扩几管，回收时胶变厚、加样孔变大，把所有PCR产物全部上样，切胶回收。
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我喜欢默默地被你注视默默地注视着你，我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
2楼2012-07-13 14:08:12
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zqx128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
条带很淡，可能是PCR的条件没优化好吧。二楼的说的挺好的。还有一个办法就是二次PCR，把第一次的产物稀释10倍当模板来扩增，也会得到比较亮的条带。祝好！
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3楼2012-07-13 14:27:11
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84146922

金虫 (小有名气)
1.条带很淡，回收还是可以的，本人曾经试过带很淡，回收之后用NANO测浓度为负值，连接转化，转化子依然很多，阳性也很多。

2.提取DNA用的试剂盒，最好让DNA与柱子充分接触，最后洗脱时候，洗脱液最好放于50-60℃预热。

3.增大提取的量。

4.做个梯度PCR，先改善退火温度，然后调节模板的量，多PCR几管。

不过还是本人试验总结，连接转化，里面有质粒，其他条件正确，就可以转出阳性转化子。
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4楼2012-07-16 08:26:20
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