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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液pcr出来后，质粒提不出，测序老失败？
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

[求助] 菌液pcr出来后，质粒提不出，测序老失败？

转化之后，在板子上挑了几个，菌落摇菌。

然后用自己的片段的特异性引物做了菌液pcr。全部是阳性。

之后又对阳性菌落划线，再挑了摇菌。又做了菌液pcr。

可是提取质粒都没有条带，测序也没有成功，很郁闷。不知道哪里出了问题~各位做过菌液pcr的高手，请帮帮忙~~~~
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1楼 2012-06-27 09:55:51
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液pcr设对照了没？一般来说不会全是阳性的，你这个全是阳性，比例太高了。做好做个对照比较一下
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2楼2012-06-27 18:05:05
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lyweichen

铁虫 (小有名气)
我通常菌液PCR完后，阳性的直接试管摇菌，提质粒。PCR最好设对照。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

emma立夏
3楼2012-06-27 19:38:17
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by lyweichen at 2012-06-27 19:38:17
我通常菌液PCR完后，阳性的直接试管摇菌，提质粒。PCR最好设对照。

请问一下，对照一般怎么设呢？谢谢，这块领域真的不是很熟悉~！
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4楼2012-06-27 19:44:25
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提质粒的问题。多收集点菌液。提完质粒测个浓度再去测序。
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5楼2012-06-27 20:39:38
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-28 15:44:40
引用回帖:
4楼: Originally posted by emma立夏 at 2012-06-27 19:44:25
请问一下，对照一般怎么设呢？谢谢，这块领域真的不是很熟悉~！...

阳性对照检查体系是否正常工作，阴性对照检查体系是否存在假阳性，你这个情况要设置阴性对照。
pcr最常用的阴性对照就是对照组体系中将模板替换为等量的灭菌水，其余与实验组保持一致，若对照产物电泳出现条带，则说明你的pcr试剂中至少有一项存在污染。
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6楼2012-06-27 21:35:54
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孔家姗妮

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

摇菌时菌浓度怎么样，我也出现过你这种问题，小量摇菌时换用2Ml的管吧，尽量保持斜面，使菌接触的空气多些，祝你好运
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7楼2013-04-06 16:01:03
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