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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[求助] 细菌RNA提取

最近在提取大肠杆菌和化脓链球菌的RNA，取对数期3mL菌液于1.5mL离心后用DEPC水清洗一次，加Trizol之前用10mg/mL的溶菌酶处理10min，离心弃上清后加入1mLTrizol，激烈振荡15 s，室温静置5 min； 每管加入 0.2 mL 的氯仿剧烈振荡 15 s后室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；吸取上层400微升水相，转入另一新的 1.5 mL 离心管， 加入等体积的异丙醇颠倒混匀；4℃，静置 1 h；4℃，12000 g，离心 10 min。但是我离心后没有看到任何沉淀，我还是按步骤操作，最后加10微升的DEPC水，然后跑了个琼脂糖电泳，看到降解的5s条带，为什么没有沉淀呢？是溶菌酶没有处理好还是静置的时间不够？后来我把菌液加大到8mL，做了加酶和不加酶处理，加异丙醇静置1h离心，只有加酶处理的化脓链球菌有明显沉淀，其它管仍没有沉淀。实在困惑啊。
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1楼2012-06-08 22:21:53
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
我觉得加酶处理的方法没有问题，Trizol试剂说明也那么写的。国外的文献也有说加溶菌酶处理。不加酶也可以提出来，但是很少。昨晚又重新做了3mL菌液加酶处理的，离心可以看到微量沉淀，浓度和纯度还行。但是我想如果我加Dnase处理，后面再用酚仿抽提，估计70%乙醇沉淀就看不到沉淀了。晚上跑个电泳看看，再来汇报。
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看天
8楼2012-06-10 16:19:41
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-09 13:44:27
1、用DEPC水洗菌液没必要，用普通缓冲液洗一下即可。
2、加trizol之前为了使菌体裂解充分，我们都是使用液氮研磨的方式来破碎细菌。况且细菌中的转录本半衰期大概只有3~8分钟，你用溶菌酶处理的过程中，RNA的表达就发生了剧烈的变化，得到的RNA丰度已经不是你理想中的情况了。
3、提RNA过程中，离心管、手套、枪头等等必须保证是无RNA酶的。
4、加入异丙醇静置10min就够了，不必1h
5、有时候，看不到沉淀不代表就没有RNA（本人亲身体会），测测OD260/280的数值就能估计到你所提RNA的量和纯度了，但这些你在实验里都没有提及；如果跑电泳的电泳液不是现配的，在跑电泳过程中一样会造成样品降解，不代表你提的样品不行。
6、据个人经验，3ml的大肠杆菌的RNA已经可以提到mg级的总RNA了，所以你起始的菌体量已经足够多了。如果菌体量太多，反而trizol相对不充分，使RNA提取有太多杂质。建议起始菌体量在1ml以下就可以了。
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2楼2012-06-09 09:17:09
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
我用1mL菌液并用带离心柱试剂盒提取的时候浓度都是30-50ng/uL左右的，260/280=2.0，浓度很低没法用，后来就改用Trizol提取，3mL提取的RNA因为没有看到沉淀伤心之下就没有测定浓度，跑电泳上样2uL时亮度明显但已经降解，不过我估计浓度也不会太高因为我才加了10uL的DEPC水溶解的。
用9mL的菌液提取的RNA样，不加酶浓度为700ng/uL，加酶的浓度大约是不加酶的两倍，260/280=1.76；可以看到沉淀的那管浓度5000ng/uL, 260/280=1.89。今天上午跑了电泳，图1的左1是加酶看到沉淀的化脓链球菌，可以看到蛋白、DNA污染，RNA降解，我把曝光调低后的图2显示的RNA位置区域怎么有三条带？左二不加酶处理也有蛋白污染，RNA降解；左三大肠杆菌加酶处理的降解得也差不多了。我都是吸取400uL的上清，而且是50uL吸的8次，怎么还那么明显的DNA存在？如果我提取完RNA后加Dnase处理，还要用氯仿来萃取，会不会更降解了？

图1 左往右依次为链球菌+溶菌酶处理、链球菌、大肠杆菌+溶菌酶处理、大肠杆菌



图2 和图1一样，只是曝光强调减小
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3楼2012-06-09 10:57:16
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scelab
引用回帖:
2楼: Originally posted by fwks3518 at 2012-06-09 09:17:09
1、用DEPC水洗菌液没必要，用普通缓冲液洗一下即可。
2、加trizol之前为了使菌体裂解充分，我们都是使用液氮研磨的方式来破碎细菌。况且细菌中的转录本半衰期大概只有3~8分钟，你用溶菌酶处理的过程中，RNA的表达就 ...

4楼2012-06-09 13:12:24
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