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lilirong2009铜虫 (小有名气)
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[求助]
细菌RNA提取
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| 最近在提取大肠杆菌和化脓链球菌的RNA，取对数期3mL菌液于1.5mL离心后用DEPC水清洗一次，加Trizol之前用10mg/mL的溶菌酶处理10min，离心弃上清后加入1mLTrizol，激烈振荡15 s，室温静置5 min； 每管加入 0.2 mL 的氯仿剧烈振荡 15 s后室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；吸取上层400微升水相，转入另一新的 1.5 mL 离心管， 加入等体积的异丙醇颠倒混匀；4℃，静置 1 h；4℃，12000 g，离心 10 min。但是我离心后没有看到任何沉淀，我还是按步骤操作，最后加10微升的DEPC水，然后跑了个琼脂糖电泳，看到降解的5s条带，为什么没有沉淀呢？是溶菌酶没有处理好还是静置的时间不够？后来我把菌液加大到8mL，做了加酶和不加酶处理，加异丙醇静置1h离心，只有加酶处理的化脓链球菌有明显沉淀，其它管仍没有沉淀。实在困惑啊。 |
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4楼2012-06-09 13:12:24
fwks3518
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-09 13:44:27
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-09 13:44:27
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1、用DEPC水洗菌液没必要，用普通缓冲液洗一下即可。 2、加trizol之前为了使菌体裂解充分，我们都是使用液氮研磨的方式来破碎细菌。况且细菌中的转录本半衰期大概只有3~8分钟，你用溶菌酶处理的过程中，RNA的表达就发生了剧烈的变化，得到的RNA丰度已经不是你理想中的情况了。 3、提RNA过程中，离心管、手套、枪头等等必须保证是无RNA酶的。 4、加入异丙醇静置10min就够了，不必1h 5、有时候，看不到沉淀不代表就没有RNA（本人亲身体会），测测OD260/280的数值就能估计到你所提RNA的量和纯度了，但这些你在实验里都没有提及；如果跑电泳的电泳液不是现配的，在跑电泳过程中一样会造成样品降解，不代表你提的样品不行。 6、据个人经验，3ml的大肠杆菌的RNA已经可以提到mg级的总RNA了，所以你起始的菌体量已经足够多了。如果菌体量太多，反而trizol相对不充分，使RNA提取有太多杂质。建议起始菌体量在1ml以下就可以了。 |
2楼2012-06-09 09:17:09
lilirong2009
铜虫 (小有名气)
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我用1mL菌液并用带离心柱试剂盒提取的时候浓度都是30-50ng/uL左右的，260/280=2.0，浓度很低没法用，后来就改用Trizol提取，3mL提取的RNA因为没有看到沉淀伤心之下就没有测定浓度，跑电泳上样2uL时亮度明显但已经降解，不过我估计浓度也不会太高因为我才加了10uL的DEPC水溶解的。 用9mL的菌液提取的RNA样，不加酶浓度为700ng/uL，加酶的浓度大约是不加酶的两倍，260/280=1.76；可以看到沉淀的那管浓度5000ng/uL, 260/280=1.89。今天上午跑了电泳，图1的左1是加酶看到沉淀的化脓链球菌，可以看到蛋白、DNA污染，RNA降解，我把曝光调低后的图2显示的RNA位置区域怎么有三条带？左二不加酶处理也有蛋白污染，RNA降解；左三大肠杆菌加酶处理的降解得也差不多了。我都是吸取400uL的上清，而且是50uL吸的8次，怎么还那么明显的DNA存在？如果我提取完RNA后加Dnase处理，还要用氯仿来萃取，会不会更降解了？  图1 左往右依次为链球菌+溶菌酶处理、链球菌、大肠杆菌+溶菌酶处理、大肠杆菌  图2 和图1一样，只是曝光强调减小 |
3楼2012-06-09 10:57:16
fwks3518
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
lilirong2009: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-06-10 16:23:35
lilirong2009: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-06-10 16:23:35
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1、细菌总RNA一般只有23s、16s、5s三条带，但这仅仅是一般情况，我之前见过沙门菌的RNA竟然有多条带，开始以为自己提的RNA质量不过关，后来有一次看文献才无意中发现个别菌株的确是多带的。你可以查查文献看看自己的菌，别人提的时候是几条带。 2、如果按照一般的标准，我个人觉得左一的RNA质粒提得还是可以的。一般我们测完RNA后按照浓度电泳只上样1ug，太多反而会影响电泳效果（有次我们有个博后电泳上样量高了，跑完之后5s亮的吓人，16、23很弱，都以为是降解了；后来降低浓度跑了一次电泳，结果就正常了。所以RNA电泳控制在上样1ug左右就可以，不要高出太多；而且你的od达到了5000ng，这个时候测得数值往往不准，可以取少量样品适当稀释后，再测） 3、初始菌量过高，会导致trizol法提得RNA杂质（包括蛋白、DNA等等）太多，仍然建议降低初始菌量； 4、rna杂质多，可以通过DNA酶处理，然后酚仿抽提去蛋白，最后用70%乙醇沉淀得到RNA |
5楼2012-06-10 10:18:46
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