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lilirong2009

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[求助] 细菌RNA提取

最近在提取大肠杆菌和化脓链球菌的RNA，取对数期3mL菌液于1.5mL离心后用DEPC水清洗一次，加Trizol之前用10mg/mL的溶菌酶处理10min，离心弃上清后加入1mLTrizol，激烈振荡15 s，室温静置5 min；每管加入 0.2 mL 的氯仿剧烈振荡 15 s后室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；吸取上层400微升水相，转入另一新的 1.5 mL 离心管，加入等体积的异丙醇颠倒混匀；4℃，静置 1 h；4℃，12000 g，离心 10 min。但是我离心后没有看到任何沉淀，我还是按步骤操作，最后加10微升的DEPC水，然后跑了个琼脂糖电泳，看到降解的5s条带，为什么没有沉淀呢？是溶菌酶没有处理好还是静置的时间不够？后来我把菌液加大到8mL，做了加酶和不加酶处理，加异丙醇静置1h离心，只有加酶处理的化脓链球菌有明显沉淀，其它管仍没有沉淀。实在困惑啊。

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1楼2012-06-08 22:21:53

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lilirong2009

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我用1mL菌液并用带离心柱试剂盒提取的时候浓度都是30-50ng/uL左右的，260/280=2.0，浓度很低没法用，后来就改用Trizol提取，3mL提取的RNA因为没有看到沉淀伤心之下就没有测定浓度，跑电泳上样2uL时亮度明显但已经降解，不过我估计浓度也不会太高因为我才加了10uL的DEPC水溶解的。
用9mL的菌液提取的RNA样，不加酶浓度为700ng/uL，加酶的浓度大约是不加酶的两倍，260/280=1.76；可以看到沉淀的那管浓度5000ng/uL, 260/280=1.89。今天上午跑了电泳，图1的左1是加酶看到沉淀的化脓链球菌，可以看到蛋白、DNA污染，RNA降解，我把曝光调低后的图2显示的RNA位置区域怎么有三条带？左二不加酶处理也有蛋白污染，RNA降解；左三大肠杆菌加酶处理的降解得也差不多了。我都是吸取400uL的上清，而且是50uL吸的8次，怎么还那么明显的DNA存在？如果我提取完RNA后加Dnase处理，还要用氯仿来萃取，会不会更降解了？

图1 左往右依次为链球菌+溶菌酶处理、链球菌、大肠杆菌+溶菌酶处理、大肠杆菌

图2 和图1一样，只是曝光强调减小

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3楼2012-06-09 10:57:16

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lilirong2009

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我觉得加酶处理的方法没有问题，Trizol试剂说明也那么写的。国外的文献也有说加溶菌酶处理。不加酶也可以提出来，但是很少。昨晚又重新做了3mL菌液加酶处理的，离心可以看到微量沉淀，浓度和纯度还行。但是我想如果我加Dnase处理，后面再用酚仿抽提，估计70%乙醇沉淀就看不到沉淀了。晚上跑个电泳看看，再来汇报。

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