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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR没东西，但是提完质粒能跑出来条带，为什么啊？
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一度冰火

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR没东西，但是提完质粒能跑出来条带，为什么啊？

本人做目的基因和PMD18-T连接，挑菌、摇菌后，对目的基因做菌液PCR筛选阳性菌株时没条带，但是我对摇出来的菌液提取质粒，然后对质粒进行目的基因PCR时跑出目的条带了，奇怪了，我前面有一次对菌液进行PCR时能跑出来，菌液PCR感觉时灵时不灵，我的PCR体系：ddH2O:14.25,BUFFER:2.5,DNTP:1,引物1:1，引物2:1，菌液：5，Taq:0.25,总共是25微升体系，哪位大侠指点下小弟呢。
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1楼 2012-05-18 18:38:50
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
一度冰火: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-18 23:26:13
嗯.............
       为什么要纠结在菌液PCR的成功率上呢 质粒PCR成功就已经是可以证明插入正确的了 个人觉得菌液PCR只是鉴定步骤 还要溶壁酶来处理后才做PCR是不是有些小题大做了呢？
       个人做法流程 一边保菌一边鉴定 像这种TA Clone 做10~20个鉴定/plate 试片段大小再调整鉴定数量 若没有阳性 再次做挑菌鉴定 还是一边保菌一边鉴定 直到把菌挑完60%左右 若你还没有阳性 就挑前边保菌摇大后提10个左右质粒 再PCR 若还没有 那就重新亚克隆吧..................
       说实话 从来没有考虑过因为菌的原因扩不出来 大肠和农杆的我都木有碰到这种情况
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Let God do with it as He wills
4楼2012-05-18 22:41:52
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
看来我们的克隆不同 我一般做2kb以上的 所以都不会有假阳性 只能说有假阴性存在 如果你是很短片段的话 假阳性确实头疼（TA克隆比较常见 最好预处理下你的PCR产物--加A-tail前最好乙醇沉淀法做一下）当然.......我懒的做，靠检验数量取胜 或者用MultiplexPCR (最近我在尝试这种菌液检验方式）就用通用引物和你特异引物统统扔到体系里 PCR出来两条带就能证明你的菌液正确
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Let God do with it as He wills
6楼2012-05-18 23:34:07
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