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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 奇怪的PCR产物
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alicelchf

木虫 (著名写手)

[求助] 奇怪的PCR产物

构建的上下游引物分别携带了PsgI(NcoI同尾酶)、XhoI位点，得到目的片段产物，然后将其回收、双酶切消化、80度灭火；
载体经过NcoI、XhoI双酶切，电泳切胶回收。
按照不同片段和载体比例进行连接ligase，转化得到质粒（6700bp左右）
问题在于（1）我们的质粒无论是试剂盒、手提得到的浓度都很少，而且是两条带（附件一20120418 pet28-10）；转化至plate有菌落，但是经过再一次双酶切之后电泳完全看不到任何片段或是载体。是我们根本没连接上吗？
（2）我们以克隆的新载体作为模板进行PCR，得到的居然更多条带（附件二20120419 pm pcr 亚克隆），初步觉得是因为引物特异性比较差，因为引物较长而且有些比较特殊的要求导致无法简短、增加特异性；所以我都怀疑我们一直以来PCR出来的事原来模板的非目的片段。所以很想知道出现这么多条带的原因有可能是什么？
顺带说一句，我们摇出来菌浑浊了，送去检测 nothing
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  • 附件 1 : 20120418 pet28-10.jpg
    • 2012-04-19 22:02:30, 9.76 K
  • 附件 2 : 20120419 pcr 亚克隆.tif
    • 2012-04-19 22:02:36, 1.25 M

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修身、齐家、治国、平天下
1楼 2012-04-19 22:03:46
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用什么酶做的酶切,同位酶连接后原来的酶是切不开的,质粒稀释100-1000再做PCR
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2楼2012-04-19 22:46:18
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-04-19 22:46:18:
你用什么酶做的酶切,同位酶连接后原来的酶是切不开的,质粒稀释100-1000再做PCR

NcoI（Psg I）,fermantas
XhoI, TAKARA

我知道切不开，所以没办法进行验证，不过倒是可以尝试但酶切，是吧

只是很纳闷那么多PCR产物是为何
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修身、齐家、治国、平天下
3楼2012-04-20 10:54:23
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alicelchf

木虫 (著名写手)
--
4楼2012-04-20 10:54:53
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-20 13:40:49
酶切验证用XhoI 。以原来的载体做模板PCR，如果和附件二20120419 pm pcr 亚克隆结果大致一致，那基本上试验就算失败了。如果不一致，不知道你要扩增的片段多大，要是那条最宽的条带的话，问题貌似不大，你可以提高退火温度试试。多条带出现的原因是很多的，比如不合适的模板，不合适的退火温度等都是原因。
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5楼2012-04-20 11:20:16
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

另外，对于问题一，两条带很正常，构象不同而已。浓度低除了操作还可能跟质粒拷贝数和菌浓有关系。
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6楼2012-04-20 11:23:00
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跳跳鱼
7楼2012-04-21 10:54:46
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jimmy7633

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议：（1）如果你的载体是低拷贝的，浓度低也正常。看了你的电泳图，应该不止2条带，质粒质量不高。要做自连对照。
（2）如果基因比较难P，可以考虑先连在pJET上，送去测序。之后在亚克隆到你的载体上。
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8楼2012-04-21 18:52:26
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jimmy7633 at 2012-04-21 18:52:26:
建议：（1）如果你的载体是低拷贝的，浓度低也正常。看了你的电泳图，应该不止2条带，质粒质量不高。要做自连对照。
（2）如果基因比较难P，可以考虑先连在pJET上，送去测序。之后在亚克隆到你的载体上。

嗯
很可能是因为不是克隆载体而是表达载体的原因，所以最近在换载体
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修身、齐家、治国、平天下
9楼2012-04-22 00:34:17
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-04-20 11:20:16:
酶切验证用XhoI 。以原来的载体做模板PCR，如果和附件二20120419 pm pcr 亚克隆结果大致一致，那基本上试验就算失败了。如果不一致，不知道你要扩增的片段多大，要是那条最宽的条带的话，问题貌似不大，你可以提高 ...

嗯 我只顾着用亚克隆的载体PCR了 是要考虑原载体pet28
我的片段400bp左右，应该就是最亮的
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修身、齐家、治国、平天下
10楼2012-04-22 00:36:04
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