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alicelchf木虫 (著名写手)
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[求助]
奇怪的PCR产物
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构建的上下游引物分别携带了PsgI(NcoI同尾酶)、XhoI位点，得到目的片段产物，然后将其回收、双酶切消化、80度灭火； 载体经过NcoI、XhoI双酶切，电泳切胶回收。 按照不同片段和载体比例进行连接ligase，转化得到质粒（6700bp左右） 问题在于（1）我们的质粒无论是试剂盒、手提得到的浓度都很少，而且是两条带（附件一20120418 pet28-10）；转化至plate有菌落，但是经过再一次双酶切之后电泳完全看不到任何片段或是载体。是我们根本没连接上吗？ （2）我们以克隆的新载体作为模板进行PCR，得到的居然更多条带（附件二20120419 pm pcr 亚克隆），初步觉得是因为引物特异性比较差，因为引物较长而且有些比较特殊的要求导致无法简短、增加特异性；所以我都怀疑我们一直以来PCR出来的事原来模板的非目的片段。所以很想知道出现这么多条带的原因有可能是什么？ 顺带说一句，我们摇出来菌浑浊了，送去检测 nothing |
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- 附件 2 : 20120419 pcr 亚克隆.tif
2012-04-19 22:02:30, 9.76 K
2012-04-19 22:02:36, 1.25 M
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