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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆为什么总是假阳性啊？
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)

[求助] TA克隆为什么总是假阳性啊？已有1人参与

我这一阵在做TA克隆，切胶回收的片段条带很清晰，但是每次连接都是假阳性或者是连不上，这是什么原因呢，求助啊！

切胶回收后的条带



第二个孔为目的条带，后面为菌落PCR结果，求解
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1楼2012-04-16 16:20:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-16 18:18:52:
你有没有做一步加A的操作呀？

我是用的Taq酶，应该不用再加A吧，不过我打算明天再加一下A试试
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3楼2012-04-16 21:30:43
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-16 21:30:43:
我是用的Taq酶，应该不用再加A吧，不过我打算明天再加一下A试试

哦，用的taq酶呀，那就不用加A啦。可能是连接的时间不够？而且连接的温度不能高于25度，你用的是什么T载体？takara的吗？
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好孩子！
4楼2012-04-16 22:57:26
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普通回帖

zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 欢迎斑斑常来啊~ 2012-04-16 21:22:42
kabuqinuo89: 金币+1 2012-04-17 17:14:11
你有没有做一步加A的操作呀？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好孩子！
2楼2012-04-16 18:18:52
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-16 22:57:26:
哦，用的taq酶呀，那就不用加A啦。可能是连接的时间不够？而且连接的温度不能高于25度，你用的是什么T载体？takara的吗？

pMD19-T载体，是宝生物的，16度保温30分钟，应该对着呢
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5楼2012-04-17 10:30:17
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alarace

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89: 金币+1 2012-04-17 17:13:52
可以先用蓝白斑做初筛，然后再用菌落PCR扩增白色菌落。这样可以增加获得阳性克隆的几率。
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6楼2012-04-17 10:33:41
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by alarace at 2012-04-17 10:33:41:
可以先用蓝白斑做初筛，然后再用菌落PCR扩增白色菌落。这样可以增加获得阳性克隆的几率。

正在尝试，蓝白斑做的只有白斑，所以囧了
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7楼2012-04-17 10:58:34
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, 斑斑很热心！ 2012-04-17 19:30:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 10:58:34:
正在尝试，蓝白斑做的只有白斑，所以囧了

这样找不到原因你可以完全从头开始做一次TA克隆，也不费事，光这么找原因也不是个办法呀，再做一遍注意每个细节
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好孩子！
8楼2012-04-17 12:36:22
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aoaoshch

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89: 金币+2 2012-04-17 17:12:16
能不能多挑几个单菌落试试？
PCR产物胶回收后立即连T载体，不要在4℃过夜。你的Amp板会不会有问题？
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9楼2012-04-17 17:01:06
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-17 12:36:22:
这样找不到原因你可以完全从头开始做一次TA克隆，也不费事，光这么找原因也不是个办法呀，再做一遍注意每个细节

已经做好几次了，都有点问题
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10楼2012-04-17 17:09:02
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