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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆为什么总是假阳性啊？
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跳跳鱼

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 10:58:34:
正在尝试，蓝白斑做的只有白斑，所以囧了

怎么会这样  那你的转化效率也太高了  不可能
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快乐奋斗，创造所有。
31楼2012-04-19 15:35:13
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跳跳鱼

木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 17:12:02:
挑了好几个，都不是很好，不过我的PCR 产物都放了段时间，没有立即做连接，可以考虑一下

平时放在-20 应该没问题
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快乐奋斗，创造所有。
32楼2012-04-19 15:36:52
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89: 金币+1 2012-04-19 18:25:58
1.蓝白斑筛选中平板问题  有没有加X-gal
2.感受态细胞问题  有没有失活，化学转化还是电转
3.T载体连接问题  连接时间，温度
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33楼2012-04-19 16:48:19
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89: 金币+1 2012-04-19 18:24:25
1. 请楼主阅读使用Taq酶的说明书，看是否加A。
2.连接T的体系中PCR产物的浓度很重要，回收后要检测在再用。
3.检测手段的问题，扩不出菌液PCR可以怀疑引物的问题，体系的问题，因为没有对照。可以将克隆摇起来提质粒，看大小，或者酶切，都可以验证是否连接成功。
4.其他操作按照说明书操作即可，同时确定药品都没有问题。
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生活是面镜子~
34楼2012-04-19 18:20:24
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:20:24:
1. 请楼主阅读使用Taq酶的说明书，看是否加A。
2.连接T的体系中PCR产物的浓度很重要，回收后要检测在再用。
3.检测手段的问题，扩不出菌液PCR可以怀疑引物的问题，体系的问题，因为没有对照。可以将克隆摇起来提 ...

引物没有问题，不过可以试试提质粒然后酶切
他们说说明书说的时间太短，1000bp得连接过夜，我的只连接了半个小时，呜呜
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35楼2012-04-19 18:24:18
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by 另一个天堂 at 2012-04-19 16:48:19:
1.蓝白斑筛选中平板问题  有没有加X-gal
2.感受态细胞问题  有没有失活，化学转化还是电转
3.T载体连接问题  连接时间，温度

化转，电转的话不知道solution中的离子对电转有没有影响
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36楼2012-04-19 18:25:19
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 跳跳鱼 at 2012-04-19 15:35:13:
怎么会这样  那你的转化效率也太高了  不可能

是啊，所以 有问题…………
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37楼2012-04-19 18:25:52
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
35楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-19 18:24:18:
引物没有问题，不过可以试试提质粒然后酶切
他们说说明书说的时间太短，1000bp得连接过夜，我的只连接了半个小时，呜呜

不知道楼主的质粒和片段大小，如果很相近的，可以适当调整连接体系比例。
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生活是面镜子~
38楼2012-04-19 18:31:21
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
38楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:31:21:
不知道楼主的质粒和片段大小，如果很相近的，可以适当调整连接体系比例。

比例改过，只长了一个假阳性，现在正在更改连接时间，不知道行不行，希望顺利
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39楼2012-04-19 18:34:51
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2007090351

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 10:30:17
pMD19-T载体，是宝生物的，16度保温30分钟，应该对着呢...

是不是连接的时间短了，16度30分钟？可以试试16度连接过夜看看啊。
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40楼2014-10-11 14:59:25
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