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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆为什么总是假阳性啊？
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by aoaoshch at 2012-04-17 17:01:06:
能不能多挑几个单菌落试试？
PCR产物胶回收后立即连T载体，不要在4℃过夜。你的Amp板会不会有问题？

挑了好几个，都不是很好，不过我的PCR 产物都放了段时间，没有立即做连接，可以考虑一下
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11楼2012-04-17 17:12:02
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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10楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 17:09:02:
已经做好几次了，都有点问题

可能是你连接的时间太短了，你多连几个小时，或者连接过夜试试
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好孩子！
12楼2012-04-17 17:13:23
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流！ 2012-04-17 19:30:43
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5楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 10:30:17:
pMD19-T载体，是宝生物的，16度保温30分钟，应该对着呢

16℃30min时间太短了，连接效率没有那么高的。我们实验室都是4℃过夜后再16℃连接2-3h，连接酶是MBI的，差不多每次都能成功连接。
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13楼2012-04-17 18:45:23
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-17 17:13:23:
可能是你连接的时间太短了，你多连几个小时，或者连接过夜试试

说明书上写的是半个小时，我是受说明书的误导，应该试着多连接几个小时
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14楼2012-04-17 19:37:19
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-04-17 18:45:23:
16℃30min时间太短了，连接效率没有那么高的。我们实验室都是4℃过夜后再16℃连接2-3h，连接酶是MBI的，差不多每次都能成功连接。

这是说明书上那么写的，估计我是受了说明书的误导了
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15楼2012-04-17 19:38:10
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 19:38:10:
这是说明书上那么写的，估计我是受了说明书的误导了

看来很有可能是这个问题呀，你连接时间长点试试吧
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好孩子！
16楼2012-04-17 21:45:58
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-17 19:38:10:
这是说明书上那么写的，估计我是受了说明书的误导了

祝顺利……
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17楼2012-04-17 22:43:01
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open3377

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89: 金币+2 2012-04-18 10:57:01
1. 用普通TAQ酶，别浪费功夫加什么A
2. 做个对照
3.检查下抗生素，板超过24h，长出来的就别要了
4. 向别人借过感受态 试试
5.PCR检测至少3遍才能确定吧，即使有，也可能扩不何处来
6. 使用载体引物，你胶上乱起八糟的，用载体引物即使空载还能看到个判断
   建议你载体引物和目的条带引物同时扩，应该能找出问题所在
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18楼2012-04-17 23:27:40
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open3377

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我连接就是半小时，没问题的
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19楼2012-04-17 23:31:23
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T载体可能有问题。我以前也碰到过，用了一个公司的T载体，自连很严重，后来索性换了另一种T载体，就一次成功了。
换一种T载体试试。
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20楼2012-04-18 08:51:24
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