[求助] TA克隆为什么总是假阳性啊？ 已有1人参与

2楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-16 18:18:52:
你有没有做一步加A的操作呀？

4楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-16 22:57:26:
哦，用的taq酶呀，那就不用加A啦。可能是连接的时间不够？而且连接的温度不能高于25度，你用的是什么T载体？takara的吗？

6楼: Originally posted by alarace at 2012-04-17 10:33:41:
可以先用蓝白斑做初筛，然后再用菌落PCR扩增白色菌落。这样可以增加获得阳性克隆的几率。

8楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-17 12:36:22:
这样找不到原因你可以完全从头开始做一次TA克隆，也不费事，光这么找原因也不是个办法呀，再做一遍注意每个细节

9楼: Originally posted by aoaoshch at 2012-04-17 17:01:06:
能不能多挑几个单菌落试试？
PCR产物胶回收后立即连T载体，不要在4℃过夜。你的Amp板会不会有问题？

12楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-17 17:13:23:
可能是你连接的时间太短了，你多连几个小时，或者连接过夜试试

13楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-04-17 18:45:23:
16℃30min时间太短了，连接效率没有那么高的。我们实验室都是4℃过夜后再16℃连接2-3h，连接酶是MBI的，差不多每次都能成功连接。

18楼: Originally posted by open3377 at 2012-04-17 23:27:40:
1. 用普通TAQ酶，别浪费功夫加什么A
2. 做个对照
3.检查下抗生素，板超过24h，长出来的就别要了
4. 向别人借过感受态 试试
5.PCR检测至少3遍才能确定吧，即使有，也可能扩不何处来
6. 使用载体引物，你胶上乱 ...

20楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-04-18 08:51:24:
T载体可能有问题。我以前也碰到过，用了一个公司的T载体，自连很严重，后来索性换了另一种T载体，就一次成功了。
换一种T载体试试。