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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆为什么总是假阳性啊？
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)

[求助] TA克隆为什么总是假阳性啊？ 已有1人参与

我这一阵在做TA克隆，切胶回收的片段条带很清晰，但是每次连接都是假阳性或者是连不上，这是什么原因呢，求助啊！

切胶回收后的条带



第二个孔为目的条带，后面为菌落PCR结果，求解
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1楼 2012-04-16 16:20:18
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:20:24:
1. 请楼主阅读使用Taq酶的说明书，看是否加A。
2.连接T的体系中PCR产物的浓度很重要，回收后要检测在再用。
3.检测手段的问题，扩不出菌液PCR可以怀疑引物的问题，体系的问题，因为没有对照。可以将克隆摇起来提 ...

引物没有问题，不过可以试试提质粒然后酶切
他们说说明书说的时间太短，1000bp得连接过夜，我的只连接了半个小时，呜呜
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35楼2012-04-19 18:24:18
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 欢迎斑斑常来啊~ 2012-04-16 21:22:42
kabuqinuo89: 金币+1 2012-04-17 17:14:11
你有没有做一步加A的操作呀？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好孩子！
2楼2012-04-16 18:18:52
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-04-16 18:18:52:
你有没有做一步加A的操作呀？

我是用的Taq酶，应该不用再加A吧，不过我打算明天再加一下A试试
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3楼2012-04-16 21:30:43
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2012-04-16 21:30:43:
我是用的Taq酶，应该不用再加A吧，不过我打算明天再加一下A试试

哦，用的taq酶呀，那就不用加A啦。可能是连接的时间不够？而且连接的温度不能高于25度，你用的是什么T载体？takara的吗？
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好孩子！
4楼2012-04-16 22:57:26
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