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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问模板开始GC含量异常的高，这种情况应该怎么P？
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tawnya

新虫 (初入文坛)

[交流] 请问模板开始GC含量异常的高，这种情况应该怎么P？

模板开始GC含量异常的高，到了后面就在50-60左右徘徊了。
是应该升高变性温度和时间+热启动吗？
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1楼 2012-04-05 16:48:27
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zx6291

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-06 17:40:34
试试在PCR体系中加入DMSO（5-10%），然后选用TaKaRa的LA酶，采用GC Buffer II，然后在梯度一下，供参考！
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6楼2012-04-06 14:32:37
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atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
tawnya(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+3, “嗯”字开头，微笑结尾，不看头像也知道是谁^_^ 2012-04-05 18:47:36
嗯...............
推荐使用擅长高GC扩的酶：如TaKaRa的LA+GC Buffer II
先尝试普通程序，变性温度跟酶有关系暂时不要调，可以提高退火时间，
只要有Smear就微调退火温度、没Smear就大胆的往下跳退火，我有一次45度退火时扩出单一条带。很是
如果实在不行，建议预处理模板，使用加矿物油99度5min后迅速冰上冷却，打开模板双链，或使用NaOH处理也可，搜搜文献，针对高GC的文章很多的
预祝实验顺利 若有说错，请高手指正哦
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2楼2012-04-05 16:54:01
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qqm8445

金虫 (正式写手)
★ ★
tawnya(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 鼓励分享经验 2012-04-05 18:47:49
有多高，我的是70%，用takala LA高GCbuffer 扩的，没有问题呀，不过感觉比较容易突变或缺失，得多挑些菌去测序
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3楼2012-04-05 17:55:47
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to-be

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接买个2×的GCbuffer加进PCR体系中就可以扩出来了
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4楼2012-04-05 22:47:32
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