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tawnya

新虫 (初入文坛)


[交流] 请问模板开始GC含量异常的高,这种情况应该怎么P?

模板开始GC含量异常的高,到了后面就在50-60左右徘徊了。
是应该升高变性温度和时间+热启动吗?
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zx6291

铜虫 (小有名气)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-06 17:40:34
试试在PCR体系中加入DMSO(5-10%),然后选用TaKaRa的LA酶,采用GC Buffer II,然后在梯度一下,供参考!
6楼2012-04-06 14:32:37
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atlanticwi

金虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★
tawnya(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+3, “嗯”字开头,微笑结尾,不看头像也知道是谁^_^ 2012-04-05 18:47:36
嗯...............
推荐使用擅长高GC扩的酶:如TaKaRa的LA+GC Buffer II
先尝试普通程序,变性温度跟酶有关系暂时不要调,可以提高退火时间,
只要有Smear就微调退火温度、没Smear就大胆的往下跳退火,我有一次45度退火时扩出单一条带。很是
如果实在不行,建议预处理模板,使用加矿物油99度5min后迅速冰上冷却,打开模板双链,或使用NaOH处理也可,搜搜文献,针对高GC的文章很多的
预祝实验顺利 若有说错,请高手指正哦
2楼2012-04-05 16:54:01
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qqm8445

金虫 (正式写手)


★ ★
tawnya(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 鼓励分享经验 2012-04-05 18:47:49
有多高,我的是70%,用takala LA高GCbuffer 扩的,没有问题呀,不过感觉比较容易突变或缺失,得多挑些菌去测序
3楼2012-04-05 17:55:47
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to-be

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
直接买个2×的GCbuffer加进PCR体系中就可以扩出来了
4楼2012-04-05 22:47:32
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