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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两段平端PCR产物的直接相连
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吴德光

禁虫 (小有名气)
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1楼 2012-04-02 12:54:39
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鱼成双

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很专业的说 2012-05-04 13:39:25
想的太复杂了，不用什么磷酸酶处理两个片段，直接做个SOE-PCR（重叠延伸片段PCR）就搞定了，快速简单。你要拼接A、B两个片段，首先设计A的上有引物和B的下游引物，然后设计A的下游（3‘）和B的上游（5’），设计A的下游引物时顶着A的末端15~20个碱基，然后再加上10~15个B 的5‘碱基作为尾巴，同理设计B的上有引物也是这样。这样设计的引物互相以对方为模板，经过一个或者两个PCR反应就拼接完成了 。
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吴德光
2楼2012-05-01 12:42:23
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吴德光

禁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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3楼2012-05-03 17:06:53
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-04 13:39:45
吴德光: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你！我理解了 2012-05-06 09:34:09
扩增产物的5和3端都是羟基，酶切过后3端是羟基，5端是磷酸基团。所以，针对你的问题：AB都需要用磷酸激酶处理加上磷酸基团。至于酶切之前还是酶切之后好像没有关系。不过，这个就算你加了磷酸基团，AB的连接是平端连接，效率会比较低。所以，这种方式可能不是一种理想的连接方式（我自己做过，效果不理想）。
还是推荐重叠法，其实重叠法没有你想的那么难的。
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4楼2012-05-03 21:44:49
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

B基因需要磷酸化A不用，然后用T4 DNA连接酶进行连接即可

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-05-03 23:35:17
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吴德光

禁虫 (小有名气)
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6楼2012-05-06 09:33:23
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吴德光

禁虫 (小有名气)
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7楼2012-05-06 09:36:16
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 13:49:54
引用回帖:
7楼: Originally posted by 吴德光 at 2012-05-06 09:36:16:
我想请问你一个，重叠延伸法不麻烦吗？我试图做过，它需要两到三轮PCR，且前两轮得切胶回收。而且第二或三轮时，是以前面的产物既为模板又作引物扩增，很难控制其退火温度，不是吗？呵呵。
不过你的回复对我很有 ...

重叠延伸确实麻烦一些，两个片段是得胶回收。至于你说的退火温度倒不是很难控制，只要引物设计得当，还是很容易的。重叠延伸，中间那两条引物设计是十分重要的 ，也是很麻烦的。如果末端磷酸化直接相连实际应用效果好的话，还是这个简便易行。但从我做的来看，貌似不行。如果，你做好了，请告所我，还请不吝赐教。呵呵
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8楼2012-05-07 09:03:20
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-07 17:53:07
需要磷酸化处理的，因为引物的5端也是羟基，pcr出来的产物没有磷酸基团，其实，重叠pcr没有那么难做吧，我感觉还挺好做的
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9楼2012-05-07 09:40:07
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-07 17:53:14
2楼说的对的，直接做SOEPCR就好了，昨晚之后如果还需要连接入载体再加磷酸基，否则不需要
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10楼2012-05-07 14:46:51
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