应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两段平端PCR产物的直接相连
111/2返回列表12下一页
查看: 2687  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

吴德光

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-02 12:54:39
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鱼成双

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很专业的说 2012-05-04 13:39:25
想的太复杂了，不用什么磷酸酶处理两个片段，直接做个SOE-PCR（重叠延伸片段PCR）就搞定了，快速简单。你要拼接A、B两个片段，首先设计A的上有引物和B的下游引物，然后设计A的下游（3‘）和B的上游（5’），设计A的下游引物时顶着A的末端15~20个碱基，然后再加上10~15个B 的5‘碱基作为尾巴，同理设计B的上有引物也是这样。这样设计的引物互相以对方为模板，经过一个或者两个PCR反应就拼接完成了 。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

吴德光
2楼2012-05-01 12:42:23
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吴德光

禁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
本帖内容被屏蔽
3楼2012-05-03 17:06:53
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-04 13:39:45
吴德光: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你！我理解了 2012-05-06 09:34:09
扩增产物的5和3端都是羟基，酶切过后3端是羟基，5端是磷酸基团。所以，针对你的问题：AB都需要用磷酸激酶处理加上磷酸基团。至于酶切之前还是酶切之后好像没有关系。不过，这个就算你加了磷酸基团，AB的连接是平端连接，效率会比较低。所以，这种方式可能不是一种理想的连接方式（我自己做过，效果不理想）。
还是推荐重叠法，其实重叠法没有你想的那么难的。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-03 21:44:49
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

B基因需要磷酸化A不用，然后用T4 DNA连接酶进行连接即可

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
5楼2012-05-03 23:35:17
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吴德光

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
6楼2012-05-06 09:33:23
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吴德光

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2012-05-06 09:36:16
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 13:49:54
引用回帖:
7楼: Originally posted by 吴德光 at 2012-05-06 09:36:16:
我想请问你一个，重叠延伸法不麻烦吗？我试图做过，它需要两到三轮PCR，且前两轮得切胶回收。而且第二或三轮时，是以前面的产物既为模板又作引物扩增，很难控制其退火温度，不是吗？呵呵。
不过你的回复对我很有 ...

重叠延伸确实麻烦一些，两个片段是得胶回收。至于你说的退火温度倒不是很难控制，只要引物设计得当，还是很容易的。重叠延伸，中间那两条引物设计是十分重要的 ，也是很麻烦的。如果末端磷酸化直接相连实际应用效果好的话，还是这个简便易行。但从我做的来看，貌似不行。如果，你做好了，请告所我，还请不吝赐教。呵呵
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-07 09:03:20
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-07 17:53:07
需要磷酸化处理的，因为引物的5端也是羟基，pcr出来的产物没有磷酸基团，其实，重叠pcr没有那么难做吧，我感觉还挺好做的
赞一下 回复此楼
9楼2012-05-07 09:40:07
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amilie030312

金虫 (正式写手)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-07 17:53:14
2楼说的对的，直接做SOEPCR就好了，昨晚之后如果还需要连接入载体再加磷酸基，否则不需要
赞一下 回复此楼
10楼2012-05-07 14:46:51
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 吴德光 的主题更新
111/2返回列表12下一页
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华中农微生物，288分，三年实验经历 +4 代fish 2026-04-09 4/200 2026-04-09 15:08 by zhyzzh
[考研] 一志愿厦大生物学332求调剂 +8 池池池池池池 2026-04-08 8/400 2026-04-09 09:53 by 天籁战国策
[考研] 本科南方医科大学 一志愿985 药学学硕284分 求调剂 +3 弱水听文 2026-04-09 3/150 2026-04-09 09:06 by susuqq
[考研] 269求调剂 +6 啊啊我我 2026-04-07 6/300 2026-04-08 20:04 by 我减肥1
[考研] 生物医药调剂｜SCI中科院三区一作+多项科研成果 +8 likangxing 2026-04-07 11/550 2026-04-08 00:02 by lys0704
[考研] 363求调剂 +9 zh096 2026-04-04 9/450 2026-04-07 21:51 by 418490947
[考研] 调剂 +4 mcbbc 2026-04-06 5/250 2026-04-07 12:33 by upczlm1989
[考研] 292求调剂 +4 lilllllxccc 2026-04-05 5/250 2026-04-07 09:29 by 纺大杨老师
[考研] 285求调剂 +15 哦呦呼o 2026-04-04 17/850 2026-04-06 23:02 by chenzhimin
[考研] 求调剂 +5 小沢 2026-04-03 5/250 2026-04-06 22:45 by 875465
[考研] 华南理工0703化学，总分336求调剂 +10 手机用户 2026-04-03 11/550 2026-04-06 22:20 by michael2011
[考研] 求调剂 +4 wos666 2026-04-03 5/250 2026-04-06 15:22 by wos666
[考研] 362求调剂一志愿中国石油大学 +4 我要考大 2026-04-06 6/300 2026-04-06 14:11 by 无际的草原
[考研] 348求调剂 +3 车厘子zzz 2026-04-05 3/150 2026-04-05 20:30 by 啵啵啵0119
[考研] 材料化工306分找合适调剂 +14 沧海轻舟e 2026-04-04 14/700 2026-04-05 09:53 by 朱云虎202
[考研] 294求调剂 +6 Grey_Ey 2026-04-02 9/450 2026-04-04 22:07 by hemengdong
[考研] 。 +5 雾与海 2026-04-02 6/300 2026-04-04 19:53 by 蓝云思雨
[考研] 297求调剂 +11 ljy20040718！ 2026-04-03 13/650 2026-04-04 09:23 by 来看流星雨10
[考研] 求调剂 +4 压力??大 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:36 by 啵啵啵0119
[考研] 工科341分调剂 +3 洛多罗 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:20 by 1753564080
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭