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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两段平端PCR产物的直接相连
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吴德光

禁虫 (小有名气)
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1楼 2012-04-02 12:54:39
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吴德光

禁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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3楼2012-05-03 17:06:53
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鱼成双

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很专业的说 2012-05-04 13:39:25
想的太复杂了，不用什么磷酸酶处理两个片段，直接做个SOE-PCR（重叠延伸片段PCR）就搞定了，快速简单。你要拼接A、B两个片段，首先设计A的上有引物和B的下游引物，然后设计A的下游（3‘）和B的上游（5’），设计A的下游引物时顶着A的末端15~20个碱基，然后再加上10~15个B 的5‘碱基作为尾巴，同理设计B的上有引物也是这样。这样设计的引物互相以对方为模板，经过一个或者两个PCR反应就拼接完成了 。
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吴德光
2楼2012-05-01 12:42:23
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-04 13:39:45
吴德光: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你！我理解了 2012-05-06 09:34:09
扩增产物的5和3端都是羟基，酶切过后3端是羟基，5端是磷酸基团。所以，针对你的问题：AB都需要用磷酸激酶处理加上磷酸基团。至于酶切之前还是酶切之后好像没有关系。不过，这个就算你加了磷酸基团，AB的连接是平端连接，效率会比较低。所以，这种方式可能不是一种理想的连接方式（我自己做过，效果不理想）。
还是推荐重叠法，其实重叠法没有你想的那么难的。
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4楼2012-05-03 21:44:49
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

B基因需要磷酸化A不用，然后用T4 DNA连接酶进行连接即可

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-05-03 23:35:17
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