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吴德光

禁虫 (小有名气)

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1楼2012-04-02 12:54:39

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yyy_zzz

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-04 13:39:45
吴德光: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你！我理解了 2012-05-06 09:34:09

扩增产物的5和3端都是羟基，酶切过后3端是羟基，5端是磷酸基团。所以，针对你的问题：AB都需要用磷酸激酶处理加上磷酸基团。至于酶切之前还是酶切之后好像没有关系。不过，这个就算你加了磷酸基团，AB的连接是平端连接，效率会比较低。所以，这种方式可能不是一种理想的连接方式（我自己做过，效果不理想）。
还是推荐重叠法，其实重叠法没有你想的那么难的。

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4楼2012-05-03 21:44:49

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yyy_zzz

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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 13:49:54

引用回帖:

7楼: Originally posted by 吴德光 at 2012-05-06 09:36:16:
我想请问你一个，重叠延伸法不麻烦吗？我试图做过，它需要两到三轮PCR，且前两轮得切胶回收。而且第二或三轮时，是以前面的产物既为模板又作引物扩增，很难控制其退火温度，不是吗？呵呵。
不过你的回复对我很有 ...

重叠延伸确实麻烦一些，两个片段是得胶回收。至于你说的退火温度倒不是很难控制，只要引物设计得当，还是很容易的。重叠延伸，中间那两条引物设计是十分重要的，也是很麻烦的。如果末端磷酸化直接相连实际应用效果好的话，还是这个简便易行。但从我做的来看，貌似不行。如果，你做好了，请告所我，还请不吝赐教。呵呵

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8楼2012-05-07 09:03:20

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