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狼在身边

木虫 (小有名气)

[求助] 关于RT-PCR的众多细节

我提取的是细菌的RNA,浓度在500ng/ul左右,但纯度很低,260/280只在1.6-1.7之间,请问这样的RNA能用吗,感觉细菌的RNA的260/280好像都很低,没有组织和植物的RNA那么好。用这样的RNA反转录之后的荧光PCR效果也不错,现在就很纠结,这种RNA纯度能用吗,请问大家提取的细菌RNA纯度都咋样,我提取RNA的试剂是TAKARA的。
   再有一个现象,提取RNA过程中添加异丙醇离心后没有RNA沉淀,后续乙醇洗脱时心里很虚。请问大家遇到过这样的问题吗?
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-28 15:07:43
紫外分光测的都不是很准的,关键看你跑的RNA电泳怎么样,电泳上跑的好的话就没什么大问题,不要去在意紫外测的,如果有DNA污染就用Dnase 1c处理下。
没有沉淀是正常的,不要发虚,吸取的时候小心点就OK啦,但是最后你一定要跑个电泳看看啊,千万不要只测紫外而不跑电泳,两者结合最好!
GOOD luck!
我就是我
2楼2012-03-28 12:58:06
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
RNA微量,所以即使看不到沉淀,但是在乙醇洗涤的时候会看见的。我也有心虚的时候,但是在洗涤的时候总是能看见RNA所以现在也就不心虚了
3楼2012-03-28 14:45:29
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huang200669

新虫 (初入文坛)

我以前试过,用260/280是2.0、1.8、1.7的RNA分别反转录做荧光,内参的CT值不一样,2.0的CT值是20,1.7的是28,我的是植物RNA。
4楼2012-03-28 16:15:12
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
看不到不代表没有 洗涤后 产物可能沉淀不是很好 倒上清细致点 不要把产物倒掉了
5楼2012-03-28 19:16:50
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狼在身边

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-03-28 12:58:06:
紫外分光测的都不是很准的,关键看你跑的RNA电泳怎么样,电泳上跑的好的话就没什么大问题,不要去在意紫外测的,如果有DNA污染就用Dnase 1c处理下。
没有沉淀是正常的,不要发虚,吸取的时候小心点就OK啦,但是最 ...

谢谢。我用的是微量核酸测定仪测量的260/280,测完心就凉了,就没有跑电泳。
6楼2012-03-28 20:24:32
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狼在身边

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 19:16:50:
看不到不代表没有 洗涤后 产物可能沉淀不是很好 倒上清细致点 不要把产物倒掉了

看不到的话,能倒嘛?会不会用枪吸出来好点?
7楼2012-03-28 20:25:31
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狼在身边

木虫 (小有名气)

狼在身边: 回帖置顶 2012-03-29 12:41:52
引用回帖:
4楼: Originally posted by huang200669 at 2012-03-28 16:15:12:
我以前试过,用260/280是2.0、1.8、1.7的RNA分别反转录做荧光,内参的CT值不一样,2.0的CT值是20,1.7的是28,我的是植物RNA。

CT的大小应该和浓度的关系更大一些吧,你测定不同260/280CT值时RNA的浓度一样吗?
8楼2012-03-28 20:28:01
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 狼在身边 at 2012-03-28 20:25:31:
看不到的话,能倒嘛?会不会用枪吸出来好点?

看情况 看不到还怎么说 是不是
看得到的时候 注意点 好不容易提取 最后还给倒掉 很伤感额 。
没试过 应该会好点 贴壁吸
9楼2012-03-28 20:51:35
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狼在身边

木虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 20:51:35:
看情况 看不到还怎么说 是不是
看得到的时候 注意点 好不容易提取 最后还给倒掉 很伤感额 。
没试过 应该会好点 贴壁吸

我试试吧,谢谢支持
10楼2012-03-28 21:05:50
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