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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR时出现了非目的片段的超大片段条带
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恶魔眼球

木虫 (小有名气)

[求助] PCR时出现了非目的片段的超大片段条带

最近做pcr一直不出结果，竟然出现了非目的片段的超大片段条带，怎么办呢。PS:我们的反应体系是20uL的：ddwater 13.7uL,buffer 2.0uL,引物各1.0uL(10uM),dNTP0.8uL,Taq 酶0.5uL(2U/uL),模板1uL;反应过程：95° 5min,(94°  40s，59°  50s, 72°  50s)35cycles,72°  10min;目的条带是1570bp的;假期前按照上述体系有结果的，只是送去测序的时候，浓度太低没有测出来。现在重新测，一样的东西，却没有结果了。各位大虾，请指点迷津~~

marker 是DL2000，最亮的ladder是750bp
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1楼 2012-03-18 10:41:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
恶魔眼球: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-19 09:39:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 恶魔眼球 at 2012-03-18 17:11:36:
对，是基因组DNA。浓度是50 ng/μL。

应该是模板，你应该先稀释，可以做上几个浓度梯度，试验一下。
延伸时间应该加长，如ls所说，至少1.5分。
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8楼2012-03-19 08:32:35
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2012-03-18 20:06:19
你的模板是啥？提取的基因组DNA，稀释过么？浓度多少？
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2楼2012-03-18 15:16:21
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极应助！ 2012-03-18 20:06:27
恶魔眼球: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-19 09:39:39
Taq酶的扩增速度一般是每分钟1kb，你产物有1.5kb,至少要用1分30秒的延伸时间啊。另外退火温度稍微高了点（相对一般程序），现在扩增不出来，我建议你试试55℃。
你跑电泳检测时上了几微升的样啊？你说的超大条带，我觉得是模板。
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4楼2012-03-18 18:05:14
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倔强的投手

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也感觉那个条带不是扩增产物，有可能是模板。按照1kb/min的话，你的延伸时间太短了，至少要一分半
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10楼2012-03-19 09:29:09
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 恶魔眼球 at 2012-03-18 18:23:41:
检测的时候上了4微升的样。嗯嗯，我也觉得应该是模板。我今天跑电泳检测了一下引物，发现上下游引物的亮度不一样。这个会有影响吗？

引物在4度放久了会降解，水也会蒸发使浓度改变。如果你的引物有一段时间了，我建议重新稀释引物。我们实验室引物在-20度存10X储备液，用时再稀释到工作浓度存于4度，另外在-80度存引物干粉。
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6楼2012-03-18 18:27:01
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蓝慧

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是模板，你延伸的时间太短了
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向着目标前进！
7楼2012-03-18 18:52:03
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
marker用的dl2000?最下面肯定是引物二聚体了啊，引物浓度高了点，我一般稀释到2uM，20的体系加2ul
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也许似乎大概是，然而未必不见得。
9楼2012-03-19 09:14:38
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yunbfly

木虫 (小有名气)
确定是不是模板，电泳时点上同等量的模板做个对照就知道了。
不过，我之前也出现过也很不好扩、不稳定的案例：2条带，一条目的长度，一条非目的长度，全部测序发现，意外发现另一个长度条带也是同一个基因，只是上游调控序列短了许多。
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16楼2012-03-21 08:57:07
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普通回帖

恶魔眼球

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-03-18 15:16:21:
你的模板是啥？提取的基因组DNA，稀释过么？浓度多少？

对，是基因组DNA。浓度是50 ng/μL。
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3楼2012-03-18 17:11:36
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恶魔眼球

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-18 18:05:14:
Taq酶的扩增速度一般是每分钟1kb，你产物有1.5kb,至少要用1分30秒的延伸时间啊。另外退火温度稍微高了点（相对一般程序），现在扩增不出来，我建议你试试55℃。
你跑电泳检测时上了几微升的样啊？你说的超大条带 ...

检测的时候上了4微升的样。嗯嗯，我也觉得应该是模板。我今天跑电泳检测了一下引物，发现上下游引物的亮度不一样。这个会有影响吗？
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5楼2012-03-18 18:23:41
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