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模板浓度高会影响反转录结果吗?
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我用同一种的模板，做了两次反转录，第一次加10微升模板，40微升反转录体系；第二次加15微升模板，同样试剂盒，40微升反转录体系。然而第二次反转录出来的cDNA浓度比第一次还要低，很奇怪。 我知道模板浓度高会影响反转录效率，但是怎么还会降低cDNA的浓度？我总认为如果模板浓度过高，反转不下去，也就达到40微升体系中CDNA的最大浓度，不知这个想法是否是错误的？请各位多指教``` |
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 【分子生物】EPI帖 |
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wanhscn(金币+8, MolEPI+1): very good! 授予专家指数！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26
koko1210(金币+1): 谢谢参与
送鲜花一朵wanhscn(金币+8, MolEPI+1): very good! 授予专家指数！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26
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加模板不是要看体积，要看RNA的量哦。反转录试剂盒上会有关于RNA模板用量的说明，可参考下。不知道你用了多少RNA，所以不好说。RNA过量至少带来2个问题： 1.反转录酶能力有限，RNA过量会造成反转录不完全，就是说有的RNA没能反转录成cDNA。如果用来定量，结果就会不准确。 2.提取RNA的过程中使用的试剂会影响酶活性，所以体积不能加太多，一般不要超过反转录体系的1/10（具体请参考试剂盒说明书）。 另外，测cDNA浓度是很奢侈的行为。反转录酶那么贵，cDNA是很珍贵的，不要浪费。一般的做法是测RNA浓度，然后不同样品都使用同样量的RNA去做反转录，这样得到的不同样品的cDNA就可以认为浓度是一样的。 |
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