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koko1210

铜虫 (正式写手)

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[交流] 模板浓度高会影响反转录结果吗?

我用同一种的模板，做了两次反转录，第一次加10微升模板，40微升反转录体系；第二次加15微升模板，同样试剂盒，40微升反转录体系。然而第二次反转录出来的cDNA浓度比第一次还要低，很奇怪。
我知道模板浓度高会影响反转录效率，但是怎么还会降低cDNA的浓度？我总认为如果模板浓度过高，反转不下去，也就达到40微升体系中CDNA的最大浓度，不知这个想法是否是错误的？请各位多指教```

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1楼 2012-03-14 19:55:04

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koko1210

铜虫 (正式写手)

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虫号: 591001

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-14 22:28:20:
加模板不是要看体积，要看RNA的量哦。反转录试剂盒上会有关于RNA模板用量的说明，可参考下。不知道你用了多少RNA，所以不好说。RNA过量至少带来2个问题：
1.反转录酶能力有限，RNA过量会造成反转录不完全，就是说 ...

明白了，非常感谢！

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3楼2012-03-15 17:57:05

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西瓜

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koko1210(金币+1): 谢谢参与

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wanhscn(金币+8, MolEPI+1): very good! 授予专家指数！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26

加模板不是要看体积，要看RNA的量哦。反转录试剂盒上会有关于RNA模板用量的说明，可参考下。不知道你用了多少RNA，所以不好说。RNA过量至少带来2个问题：
1.反转录酶能力有限，RNA过量会造成反转录不完全，就是说有的RNA没能反转录成cDNA。如果用来定量，结果就会不准确。
2.提取RNA的过程中使用的试剂会影响酶活性，所以体积不能加太多，一般不要超过反转录体系的1/10（具体请参考试剂盒说明书）。

另外，测cDNA浓度是很奢侈的行为。反转录酶那么贵，cDNA是很珍贵的，不要浪费。一般的做法是测RNA浓度，然后不同样品都使用同样量的RNA去做反转录，这样得到的不同样品的cDNA就可以认为浓度是一样的。