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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 模板浓度高会影响反转录结果吗?
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koko1210

铜虫 (正式写手)

[交流] 模板浓度高会影响反转录结果吗?

我用同一种的模板，做了两次反转录，第一次加10微升模板，40微升反转录体系；第二次加15微升模板，同样试剂盒，40微升反转录体系。然而第二次反转录出来的cDNA浓度比第一次还要低，很奇怪。
我知道模板浓度高会影响反转录效率，但是怎么还会降低cDNA的浓度？我总认为如果模板浓度过高，反转不下去，也就达到40微升体系中CDNA的最大浓度，不知这个想法是否是错误的？请各位多指教```
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1楼 2012-03-14 19:55:04
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koko1210

铜虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-14 22:28:20:
加模板不是要看体积，要看RNA的量哦。反转录试剂盒上会有关于RNA模板用量的说明，可参考下。不知道你用了多少RNA，所以不好说。RNA过量至少带来2个问题：
1.反转录酶能力有限，RNA过量会造成反转录不完全，就是说 ...

明白了，非常感谢！
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3楼2012-03-15 17:57:05
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
送鲜花一朵
wanhscn(金币+8, MolEPI+1): very good! 授予专家指数！辛苦！ 2012-03-15 00:01:26
加模板不是要看体积，要看RNA的量哦。反转录试剂盒上会有关于RNA模板用量的说明，可参考下。不知道你用了多少RNA，所以不好说。RNA过量至少带来2个问题：
1.反转录酶能力有限，RNA过量会造成反转录不完全，就是说有的RNA没能反转录成cDNA。如果用来定量，结果就会不准确。
2.提取RNA的过程中使用的试剂会影响酶活性，所以体积不能加太多，一般不要超过反转录体系的1/10（具体请参考试剂盒说明书）。

另外，测cDNA浓度是很奢侈的行为。反转录酶那么贵，cDNA是很珍贵的，不要浪费。一般的做法是测RNA浓度，然后不同样品都使用同样量的RNA去做反转录，这样得到的不同样品的cDNA就可以认为浓度是一样的。
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koko1210
2楼2012-03-14 22:28:20
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华晔-123

铜虫 (初入文坛)
★
koko1210(金币+1): 谢谢参与
模板浓度确实会影响反转录的效率，而且一般试剂盒说明上也会表明RNA不超过的量，一般不超过1ug....
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5楼2012-03-22 13:31:23
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