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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 虚心请教关于平—粘末端的连接问题
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thendlee

金虫 (正式写手)

[求助] 虚心请教关于平—粘末端的连接问题

用sal I和sca I这两个酶处理过目的片段和载体，纯化回收后连接，转化后板没有菌落，不知道哪里出现了问题。
这两个酶，处理后一个产生粘性末端，一个产生平末端，有人说这样的按正常的连接体系条件就可以，但我一直没有成功。
我在做的是构建全长，最后的这个1800bp的片段怎么也加不进去。
关于目的片段：是PCR产物，纯化处理过，测序正确。
关于载体：确定有这两个酶切位点，并且唯一。
关于T4连接酶：分别用过TAKARA、NEB、以及Fermentas。
关于连接体系：调整过多次比例。
关于反应温度：试过16度过夜、22度4小时等等。
关于抗性：这个还是不会弄错的。
关于感受态：自己做的，商品化的都用过

[ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ]
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1楼 2012-03-12 19:29:35
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preciousun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
thendlee: 金币+1, ★有帮助 2012-03-16 15:44:50
你的连接有三种情况, 载体自身平末端连接, 片断自身平末端连接,都不长菌;只有你期望的载体和片断的连接才是长菌得
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9楼2012-03-15 08:21:54
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1369015

铁虫 (初入文坛)
那请问sal I 和sac I 在目地DNA片段上也是唯一的吗？还有你确定你把载体切开了吗？确定下带了吗？如果载体和片段什么问题都没有，建议使用多种感受态做，比如TOP10，EPI300，EPI400，JIM108，JT115都可以尝试一下，还有就是在37度恒温培养不行就换30度。
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2楼2012-03-12 19:55:54
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thendlee

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1369015 at 2012-03-12 19:55:54:
那请问sal I 和sac I 在目地DNA片段上也是唯一的吗？还有你确定你把载体切开了吗？确定下带了吗？如果载体和片段什么问题都没有，建议使用多种感受态做，比如TOP10，EPI300，EPI400，JIM108，JT115都可以尝试一下 ...

嗯 片段上也是唯一的  载体我是分别单酶切的 这个应该没问题
我再试试其他感受态吧 谢谢
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3楼2012-03-13 10:38:31
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跳跳鱼

木虫 (著名写手)
我也想知道
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快乐奋斗，创造所有。
4楼2012-03-13 13:58:52
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