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thendlee金虫 (正式写手)
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[求助]
虚心请教关于平—粘末端的连接问题
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用sal I和sca I这两个酶处理过目的片段和载体，纯化回收后连接，转化后板没有菌落，不知道哪里出现了问题。 这两个酶，处理后一个产生粘性末端，一个产生平末端，有人说这样的按正常的连接体系条件就可以，但我一直没有成功。 我在做的是构建全长，最后的这个1800bp的片段怎么也加不进去。 关于目的片段：是PCR产物，纯化处理过，测序正确。 关于载体：确定有这两个酶切位点，并且唯一。 关于T4连接酶：分别用过TAKARA、NEB、以及Fermentas。 关于连接体系：调整过多次比例。 关于反应温度：试过16度过夜、22度4小时等等。 关于抗性：这个还是不会弄错的。 关于感受态：自己做的，商品化的都用过 [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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thendlee
金虫 (正式写手)
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preciousun
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助, 我一个是粘性 一个是平端 为什么自连呢？再说自连也应该长菌啊，可板上什么都没。。。 2012-03-14 19:54:13
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thendlee(金币+2): ★有帮助, 我一个是粘性 一个是平端 为什么自连呢？再说自连也应该长菌啊，可板上什么都没。。。 2012-03-14 19:54:13
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楼主你好! 是这样的, 一般平末端连接效率很低的, 更何况1.8kb已经是比较大的片段了! 有几个建议: 1.根据载体的分子量, 严格控制载体: 目的片段的mol=1:1, 16度连接过夜 2.切开的载体去磷酸化,防止自体连接 3. 先连接到T载体上, 再选用T载体和你的目的载体上都有而目的片段上没有的粘性末端内切酶同时酶切T和目的载体, 连接 或者 选用目的载体上别的内切酶; 重新换引物PCR目的片段 |
5楼2012-03-14 09:22:45