| 查看: 4373 | 回复: 18 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
thendlee金虫 (正式写手)
|
[求助]
虚心请教关于平—粘末端的连接问题
|
||
|
用sal I和sca I这两个酶处理过目的片段和载体，纯化回收后连接，转化后板没有菌落，不知道哪里出现了问题。 这两个酶，处理后一个产生粘性末端，一个产生平末端，有人说这样的按正常的连接体系条件就可以，但我一直没有成功。 我在做的是构建全长，最后的这个1800bp的片段怎么也加不进去。 关于目的片段：是PCR产物，纯化处理过，测序正确。 关于载体：确定有这两个酶切位点，并且唯一。 关于T4连接酶：分别用过TAKARA、NEB、以及Fermentas。 关于连接体系：调整过多次比例。 关于反应温度：试过16度过夜、22度4小时等等。 关于抗性：这个还是不会弄错的。 关于感受态：自己做的，商品化的都用过 [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
大佬帮着分析今年的评审意见？该课题连续申请了三年了，明年要不要换个方向。
已经有11人回复
-
两块石头
已经有10人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有6人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有8人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有6人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 虚心请教，认真回答！关于包覆和掺杂的问题
已经有11人回复
- 平末端加A尾连接T载体的问题
已经有14人回复
- PCR产物平末端化问题
已经有5人回复
- DNA片段连接到载体上都有什么方法
已经有6人回复
- DNA片段化问题
已经有9人回复
- 平末端连接不上，求助
已经有21人回复
- 关于平末端连接
已经有14人回复
- puc18 载体的疑问
已经有4人回复
- 一个平末端和粘性末端怎样连接比较好
已经有8人回复
- 平末端连接，连上了，很多转化子中没有一个正确的，怎么办？
已经有13人回复
- 谁用过Fermentas的T4连接酶？
已经有23人回复
- 平末端连接做不出来克隆
已经有30人回复
- T4连接酶连接问题
已经有7人回复
- 请教，关于通过PWSCF用wannier90计算介电极化和hopping integral的方法
已经有8人回复
- 请教下实验室怎么让荧光粉较好的粘接在陶瓷片（玻璃板）上面
已经有7人回复
- 谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？
已经有7人回复
- 【求助】关于1H-NMR聚合物末端H位移问题
已经有6人回复
- 【求助】关于Gambit中几何元素的连接问题
已经有4人回复
- 【求助】请教导体和电介质带电的基础概念问题
已经有3人回复
- 【求助/交流】DNA片段连接的温度和反应条件
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于去磷酸化
已经有7人回复
- 【求助/交流】粘性末端连接问题
已经有12人回复
- 【求助】请教一个关于液体皂增稠的问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于T载体连接问题
已经有22人回复
- 【求助/交流】平末端必须去磷酸化吗
已经有6人回复
- 【求助】请教比旋光度偏高的问题
已经有8人回复
preciousun
金虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 830.9
- 散金: 770
- 红花: 3
- 帖子: 107
- 在线: 109.2小时
- 虫号: 967367
- 注册: 2010-03-11
- 专业: 抗肿瘤药物药理
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助, 我一个是粘性 一个是平端 为什么自连呢？再说自连也应该长菌啊，可板上什么都没。。。 2012-03-14 19:54:13
感谢参与，应助指数 +1
thendlee(金币+2): ★有帮助, 我一个是粘性 一个是平端 为什么自连呢？再说自连也应该长菌啊，可板上什么都没。。。 2012-03-14 19:54:13
|
楼主你好! 是这样的, 一般平末端连接效率很低的, 更何况1.8kb已经是比较大的片段了! 有几个建议: 1.根据载体的分子量, 严格控制载体: 目的片段的mol=1:1, 16度连接过夜 2.切开的载体去磷酸化,防止自体连接 3. 先连接到T载体上, 再选用T载体和你的目的载体上都有而目的片段上没有的粘性末端内切酶同时酶切T和目的载体, 连接 或者 选用目的载体上别的内切酶; 重新换引物PCR目的片段 |
5楼2012-03-14 09:22:45
2楼2012-03-12 19:55:54
thendlee
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1567.1
- 散金: 3
- 红花: 3
- 帖子: 894
- 在线: 72.5小时
- 虫号: 684876
- 注册: 2008-12-30
- 性别: GG
- 专业: 疫苗学
3楼2012-03-13 10:38:31
4楼2012-03-13 13:58:52
100